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组织总RNA抽提 交大医学院检验系生化教研室 陈 宁 * RNA简介 RNA 腺嘌呤（A） 尿嘧啶（U） 胞嘧啶（C） 鸟嘌呤（G） 四种核苷酸串联组成的单链。 A-U G-C DNA 胸腺嘧啶(T) * RNA的主要类型有三种： 信使RNA（mRNA） 转录DNA上的遗传信息 核糖体RNA（rRNA） 与蛋白质结合形成核糖体，形成细胞内蛋白质合成的场所 转移RNA（tRNA） 运输被激活的氨基酸，翻译mRNA上的氨基酸序列 真核细胞中还存在 不均一RNA (hnRNA) 小核RNA (snRNA) * * tRNA * mRNA与蛋白质的表达具有关联性。 控制生物性状的基本单位是基因，而生物性状的表达则主要通过蛋白质。 研究发现，所有基因均先转录成mRNA，再翻译成蛋白质。 生物遗传中心法则 * 细胞内RNA转录过程 * 与RNA有关的研究方法 RT-PCR mRNA通过RT-PCR（逆转录-PCR），可建立相应cDNA文库 RNA序列分析 潜在基因分析 Northern 杂交 用于真核细胞中RNA表达和大小的检测分析（RNA-DNA探针） RNA干扰技术（RNAi） 通过双链小干扰RNA（siRNA）的形成，诱导同源mRNA降解 * 组织RNA的抽提和纯化 RNA质量的标准 完整性 — 避免外源性及内源性RNase对RNA的降解 均一性 — 有效去除抽提过程中残留的DNA、蛋白质和有机溶剂 * 组织RNA抽提纯化方法 TRIzol试剂抽提法 利用含异硫氰酸胍成分的TRIzol破碎组织细胞，并抑制细胞释放的核酸酶。 硅胶膜纯化柱抽提法 硅胶膜纯化柱能迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇等沉淀，只须不断洗脱即可得到高纯度的RNA。 * 组织（50mg）+ Trizol（1ml），制成匀浆 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 取上清液，加入等体积异丙醇，静置 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 弃上清液，加入75%乙醇-DEPC H2O 离心12000rpm 3min 实验的主要操作步骤 弃上清液，自然干燥后，加入DEPC-H2O溶解，定量测定 加入氯仿（200μl），颠倒混匀，静置片刻 START * 组织应先用生理盐水冲洗，去除残留的血液，用剪刀等切成小块 TRIzol试剂 常用总RNA抽提试剂 苯酚：裂解细胞，有效变性蛋白质。 异硫氰酸胍： 解偶剂，强力蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。同时，异硫氰酸胍也是常用RNA抑制剂，可使RNase失活。  组织+ Trizol，制成匀浆 8 -羟基喹啉：抑制RNase。 β-巯基乙醇：破坏RNase蛋白质中的二硫键。 * 氯仿 学名：三氯甲烷 英文名：Chloroform 加入氯仿（200μl），颠倒混匀，静置片刻 作用： ① 蛋白变性剂 ② 溶解、去除前一步操作中残留的苯酚 * * 离心之后，样本一般分为水样层、中间层和有机层。 RNA存在于水样层中。 ** 在除去水样层后，亦可用沉淀法来逐步分离样品中的DNA和蛋白质。如：乙醇沉淀中间层的DNA；在有机层中加入异丙醇，沉淀蛋白。 高速离心 12000rpm 4℃ 10min * 中间层 水相 * 俗称IPA，是正丙醇（CH3CH2CH2OH）的同分异构体。 在抽提过程中进一步溶解样本中的蛋白质，沉淀RNA，起到纯化作用。 静置主要为了提高沉淀效率。 取上清液，加入等体积异丙醇，静置 异丙醇 ** 吸取上清液时，尽量不要混入任何中间层 物质，否则会出现染色体DNA污染。 * 离心前RNA沉淀通常不可见。 再次离心后，样本中的RNA将会沉积于管壁或管底部。 上清液中为异丙醇、残余蛋白质。所以尽可能去除上清液。 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 上清液 RNA * 主要用于RNA的洗涤，去除实验前的金属盐，而RNA自身不溶于乙醇。 混匀时，应尽量使沉淀悬浮于溶液中。 加入75%乙醇-DEPC H2O DEPC-H2O DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 * 离心 12000rpm 3min 弃上清液，自然干燥后，加入DEP