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(二）真核表达系统 组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式 据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 （三）转化 1、原生质体法：去除厚壁 2、电穿孔法：效率较高 （四）外源基因的表达 1、胞内表达 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列 （五）难点 不能实现全部的翻译后修饰功能 高成本的培养体系，技术要求高 复杂的筛选方法 Clontech Laboratories, Inc. 螺旋网用户名：红果源 联系方式：guoyi_liang@163.com QQ：526780893 利用基因工的程方法表达蛋白 整体设计 基因克隆(gene cloning) 基因表达(gene expression) -原核基因表达 -真核基因表达 概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程 基因克隆(gene cloning) 一、概述 确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码 基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 二、克隆载体 复制基因 选择性记号 克隆位点 三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性 四、体外重组的策略 2、平末端连接： 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA 效率低，酶用量大 1、粘末端连接 定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略 粘-粘连接 粘-平连接 3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段 4、T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A 五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库,包含了该生物的所有基因。 2、构建cDNA文库 以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。 3、PCR 适用于克隆序列清楚的基因,以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难, 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法, 4、人工合成 （二）体外重组 连接体系的建立： 温度：粘末端连接：12-18℃ 平末端连接：室温（低于30℃) DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3 酶量：平端连接时需加大酶量 （三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 原位杂交 2、鉴定： 长度鉴定：酶切、PCR 方向鉴定：联合酶切 测序 基因的表达 Gene Expression 一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 二．原核生物基因结构和表达特点 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因，操作基因)、 结构基因 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT