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微生物学基本实验方法和诊断技术 潘培根 一、细菌形态学检查 （一）显微镜：临床微生物学检查常用普通光学显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜。（二）细菌染色标本检查 1.常用染料 用于细菌染色的染料多为人工合成的含苯环的化合物。染料分子带有染色基团和助色基团。染色基团使染料呈现一定的颜色，使细菌着色；助色基团使染料分子与细菌结合，这样细菌才能着色。助色基团所含的化学结构决定了染料的酸碱性。 常用染料 （1）碱性染料：碱性染料电离后,染料的助色基团带正电荷，可使带负电荷的细菌染上颜色。碱性染料常为氯化物、硫酸盐、醋酸盐或草酸盐。 水 染色基团－助色基团－酸根───→染色基团－助色基团＋＋酸根－由于细菌常处于中性或弱碱性环境，细菌等电点为pH2－5，因此细菌带负电荷，细菌染色常用的染料是碱性染料。常用的碱性染料是碱性苯胺染料，如美兰、碱性复红和结晶紫。 常用染料 （2）酸性染料：酸性染料电离后，助色基团带负电荷，因此不能使带负电荷的细菌染上颜色，不常用于细菌染色。如果使细菌悬液的pH降至等电点（pH2－5）以下，细菌带正电荷，则可使细菌染上颜色。酸性染料常为与Na+、K+、Ca2+、NH4+结合的盐类。 水 染色基团－助色基团－Na───→染色基团－助色基团－＋Na＋常用的酸性染料如伊红、酸性复红、刚果红等。 常用染料 （3）中性染料：又称复合染料，是碱性染料与酸性染料结合形成的复合物，如姬姆萨染料（伊红天青）、瑞氏染料（伊红美兰）。细菌染色不用此种染料，衣原体染色可用此种染料。 2．常用染色方法 （1）单染色法：单用一种碱性染料使细菌着色，常用美兰染色。用于观察细菌的形态、大小及排列。 （2）复合染色法（鉴别染色法）：用两种碱性染料使细菌先后染色，即一种染料作为复染剂，并在初染后用脱色剂脱色，然后再复染，以区别细菌的着色性（细菌着上哪种颜色），从而鉴别细菌。复合染色法常用来观察细菌的形态、大小、排列和着色性。临床常用的复合染色法有革兰染色法和抗酸染色法。革兰染色法 紫色－革兰阳性菌 红色－革兰阴性菌抗酸染色法 红色－抗酸性细菌 兰色－非抗酸性细菌 （三）不染色标本检查 1．悬滴法 用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜观察细菌的形态和运动方式 2．压滴法 用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜观察细菌的形态和运动方式 二、细菌的人工培养及生化试验 （一）培养基1．培养基的概念：人工配制的适合细菌生长繁殖需要的营养基质。培养基必须具备细菌生长繁殖所需要的营养物质和适宜的pH（一般pH7.2－7.4）。 培养基的种类—按用途分类 （1）基础培养基：含有细菌生长繁殖所需要的基本营养成分，主要用于营养要求不高的细菌的生长。临床常用牛肉浸汤、普通琼脂平板、普通琼脂斜面和普通琼脂半固体。（2）普通培养基：在基础培养基中加入葡萄糖、血液（兔脱纤维蛋白血、羊脱纤维蛋白血）、血清（兔血清、牛血清、马血清等）、生长因子（维生素B族－酵母浸膏，X因子－氯化高铁血红素、V因子－辅酶I和辅助II等）等特殊营养物质，即为营养培养基。主要用于营养要求较高的细菌的生长。临床常用葡萄糖肉汤、血清肉汤、血琼脂平板、巧克力琼脂平板。临床最常用的是血琼脂平板。 培养基的种类—按用途分类 （3）鉴别培养基：在培养基中加入特定的底物和指示剂，即为鉴别培养基。鉴别培养基用来作细菌的生化试验，以便鉴定细菌，因此这类培养基是临床细菌检验常的培养基。如糖发酵培养基、克氏双糖铁培养基（KIA）、动力－吲哚－尿素（MIU）培养基等。 培养基的种类—按用途分类 （4）选择培养基：在培养基中加入某种化学物质或抗生素，以抑制某些细菌种类生长，有助于需要的细菌种类生长。此类培养基主要用于从含菌种类（主要是正常菌群）较多的标本（如粪便）中分离培养专性病原菌。如胆盐培养基、SS琼脂、麦康凯琼脂、中国兰琼脂、伊红－美兰琼脂用于从粪便中分离培养志贺菌和沙门菌；庆大霉素琼脂、碱性琼脂用于从粪便中分离培养霍乱弧菌。（5）特殊培养基：包括培养细菌L型的培养基，培养厌氧菌的厌氧培养基。这类培养基用于培养营养要求和生长条件较特殊的细菌。 培养基的种类--按物理性状分类 （1）液体培养基：常用于增菌培养和做生化试验。（2）固体培养基：在液体培养基中加入1.5-2.0%琼脂，高压热溶后冷凝即为固体培养基。 琼脂平板：常用于细菌的分离培养、鉴定、纯化和药敏试验。 琼脂斜面：常用于菌种短期保存（3）半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.5%