体内药物分析_薄层色谱法　PPT课件精选.ppt

* 样品预处理：TLC法直接取离心后血清 测定TLC法：用微量注射器分别取乐果标准溶液和血清样品各2μL ，点在薄层板上，展开剂 1：1(v／v)正己烷：丙酮 1-5，10、50、100、200、500 μg/ml乐果标准溶液 * ? ? ? * * * * * 可根据样品分离的难易程度、实验的重要性和经济因素等方面有针对性地选择普通（TLC）、高效（HPTLC）、球形（HPTLC Sphere）或超高效（UPTLC）薄层板中的一种； （丁黎P4）近年来，超薄层色谱法（ultra-thin-layer chromatography,UTLC），因其仅10 um的硅胶层整体结构，显著降低了迁移时间和溶剂消耗，并提高了灵敏度，为薄层色谱法开创了一个全新领域。 * * 现代薄层色谱常用的固定相 与早期薄层色谱法相比，现代薄层色谱法可供采用的固定相种类繁多，其中一些常用的商品化薄层板的固定相有： 硅胶：强极性，正向分配色谱。适用范围广，占薄层吸附和分配色谱80%的应用。 C18：弱极性，反相分配色谱。 C18/W：弱极性，适用于任何含水比例的流动相 C2: 中等极性 手性C18： Diol: 二醇醚改性，中强极性，可使用各种展开剂，可替代硅胶用于重现性要求较高的分析 NH2：丙氨基改性，中等极性，具弱的离子交换特性。 CN：丙基腈改性，中等极性，可使用各种展开剂，适合全二维色谱分离 尼龙（聚酰胺）6：极性成分的分离 纤维素：亲水化合物的分配层析 硅藻土：无机离子，除草剂，甾醇 中性碱性氧化铝：萜类，生物碱，甾醇，脂肪类和芳香类化合物 * 提高分辨效率：分辨率与吸附剂微粒半径的平方成反比 缩短分析时间：展开速度与吸附剂颗粒半径成正比，故颗粒越小，展开速度越慢，但因分离效率提高了之后可以大大缩短展开距离。 增加检出灵敏度：使斑点集中在一条线，斑点的单位面积中样品浓度增加，从而提高检出灵敏度。 * * * （不讲 方法学 TLC是一项离线色谱技术，所有步骤独立（包括点样、展开、衍生、照相、检测和计算等），按照时间和位置分割，这就提供了非常广的灵活性。同时，许多的独立参数对分析结果会产生影响。由于薄层板是一次性使用的，这就确保了所有的样品和标准品在完全一致的条件下分离。同样的原因，在薄层色谱中样品基质对固定相的污染不是问题，不象柱色谱那样，而且展开后的色谱保存在薄层板上，可用不同参数进行多次计算，不必重复分离。另一方面，TLC是一个开放系统，结果受到许多因素影响，例如实验室中的光线、氧气、烟雾、湿度和尘埃等，因而实际操作中要将尽可能多的参数——尤其是展开室的立体结构和饱和、点样体积和溶剂及薄层的类型和活性——标准化并保持固定。） 点样 点样过程需满足两个基本要求：第一，点样位置需精确；第二，尤其对于定量分析，点样体积需要精确和准确。 为了提高分离效率，原点在展开方向应该尽可能小，对于HPTLC，应小于1.5mm， 这就使得采用点状点样时体积受到严格限制。在HPTLC板上点状点样体积通常为0.1-1μL。点状点样时样品溶剂在薄层板上扩散会分离样品从而在原点产生环状的所谓“环形色谱”，这会使样品组份在点样点上分布不规则，导致展开后斑点扩散不对称。为了确保原点位置紧凑，选用的样品溶剂溶解性应尽可能小。----体积小，精密度没保证！ 通过比较可以看到，采用非接触喷雾式条带状点样，在同样的色谱条件下，可提高解析度和检测限。条带状点样可确保样品在整个长条上分布均匀。对于低浓度样品，它也可以通过增大点样体积提高分辨率而不必担心条带的质量变差 * * * * * 反射吸收检测法以单色光照射斑点，在与入射光成45°角的方向测量反射光，并通过反射光的强度变化来判断组分的含量 。 * * * * * * * 从以上色谱图可看出，即使用HPTLC,但其灵敏度、分离度及重复性比HPLC\GC要差。花30多万不值得！ * * * * 对标准品的一点进行扫描，与后面不同 * * 稳定性试验 板内误差测定 仪器精密度测定 回收率试验 都很好，但板间误差较大（国产板 青岛海洋化工厂） 板间差异大，意味着：一次实验用一块板、每块板带有工作曲线点、用进口板、 若你的工作单位没钱买HPLC仪，但又要做体内药物分析，你选择哪种方法？（从光谱法、HPTLC法中选一种） 我建议用HPTLC。只要浓度不是太低（如环孢素）的药物，可分离测定。 如苯妥英钠 ：有效浓度10-20，用10、15、20标准点与板上，用目测对比法。 14、16没有什么本质的差异，但有没有监测却有本质的差异。 * 目的： 测定乐果中毒，其血中浓度高, 快速 在试验设计上有问题！ 应该 1.标准、血样有机溶剂提取后点样（典型做法，但浪费了宝贵的时间） 2. 标准