利用流式细胞术分析细胞周期时相精选.ppt

细胞生物学实验 流式细胞术分析细胞周期时相 实验目的 实验原理 仪器、材料与试剂 实验步骤 实验报告及思考题 * 实 验 目 的 掌握流式细胞仪的工作原理 掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA含量分布的方法 了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用 细胞周期时相分析 * 实 验 原 理 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。 细胞周期时相分析 * 仪器、材料与试剂 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存）， PI （650μg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH 7.4，保存于4℃) 细胞周期时相分析 * 实 验 步 骤 取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800rpm , 离心 15 min去上清。 PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。 用5mL注射器将细胞吸起，用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周） 800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次 用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎） 加RNase-A约3μL至终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min； 加PI约50μL至终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测 样品分析测定及打印 细胞周期时相分析 * 实 验 报 告 及 思 考 题 实验报告 标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？ 思考题 流式细胞术在科学研究中的应用 本实验为何要采用对数生长期的细胞？ 细胞周期时相分析 *