动物细胞培养制药工艺精选.ppt

* 3 EPO的质控与活性检测 得到红细胞生成素纯品后，测定纯度、蛋白含量、分子量等物理化学性质和体内生物学活性。 体外活性：ELISA测定（原理免疫沉淀），单位unit（IU） 体内活性：网织红细胞计数法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。 比活性(specific activity, U/mg)：单位重量蛋白质(mg) 中所含的活性 * 本章结束 * 5 兼性贴壁依赖性细胞 概念： 对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。 举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。 理想的药物生产细胞系。 * 二 动物细胞培养基本过程 1 原代细胞分离与培养 2 传代细胞培养 * 1 原代细胞培养－过程 动物组织或器官 洗涤 粉碎 酶解消化 离心或过滤 洗涤 培养液稀释细胞 接种培养 从体内取出组织或器官 经过粉碎、消化而获得单细胞 进行体外接种培养。 37℃消化，胰蛋白酶，胶原酶 工作浓度：0.1-0.3 mg/ml * 2 传代细胞培养－过程 概念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。 传代时期：刚刚全部汇合的细胞。 消化方法：过程与原代细胞相同。 传代的次数：不能无限次传代，保证特性。 防止细胞系之间、非细胞生物的污染。 要领：适宜的时期和方法，不要过度。 * 三 动物细胞大规模培养方法 1、根据培养细胞可分为 原代细胞培养和传代细胞培养； 2、根据培养容器和方式可分为 静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养； 3、实际生产可分为 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 * 1 单层贴壁培养——概念与过程 细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层细胞的培养过程。 生长过程：接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面； 进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。 数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。 * 单层贴壁培养——特点 优点： 容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度；有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。 缺点： 操作较繁杂，检测受到限制，培养条件难以均一，传质和传氧差，放大培养是瓶颈。 * 2 悬浮培养 细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培养过程。 优点：操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。 缺点：细胞体积小，密度低，培养病毒易失去标记而降低免疫能力。 适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤 借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。 * 3 微载体培养 概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中的培养过程。 优点：细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，减少了劳动强度，容易放大。 兼具贴壁和悬浮培养的双重优点 微载体，多孔微载体 应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原。 * 4 固定化培养 概念：用物理、化学方法将细胞固定在载体介质上，然后进行悬浮培养。 应用：贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞。 优点：细胞密度高、抗剪切力和污染，生产首选 方法 共价交联：双功能试剂处理，细胞之间交联。 吸附：物理吸附使细胞贴附在固体载体表面。 包埋：细胞包埋在载体内部。 微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。 * 4.4 基因工程细胞的构建和筛选 * 概述 基因工程动物细胞系的构建与基因工程菌的构建过程类似。 1、在细菌中构建序列正确的表达载体 2、转染动物细胞 3、筛选鉴定、获得生产用工程化细胞 * 1、真核细胞基因表达载体的构建 常用病毒或质粒载体： 用杆状病毒作载体的优点：该病毒基因是双链的容易进行重组；插入7-8千碱基对不影响正常病毒的形成；可用外源基因更换部分病毒基因，仍具有感染力；有很强的启动子；用光学显微镜可见，容易挑选阳性克隆；可直接表达外源基因。构建穿梭质粒载体的基本成分： 允许载体在细胞内扩增的质粒序列；含有能使基因转录表达调控元件；能用以筛选出外源基因已整合的选择标记；有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。 * 2、基因载体的转染和导入 基因导入方法有：融合法、化学法、物理法、病毒法。最常用磷酸钙沉淀和电穿孔法。 磷酸钙沉淀法，将溶解的DNA加在磷酸氢二钠溶液中，再逐渐加入氯化钙溶液，当磷酸氢二钠和氯化钙形成磷酸钙沉淀时，DNA被包裹在当中，形成DNA-磷酸钙共沉淀。当沉淀物与细胞表面接触时，通过细胞吞噬作用将DNA导入其中。优点是方法简单、可进行共转化，可将不含选择性标记的DNA和含选择性标记的DNA放在一起进行形成混