RNAi技术专题讲座PPT汇总.ppt

RNA的分类 RNAi技术 RNAi技术 被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。 RNAi现象的普遍性 RNAi普遍存在于水稻、烟草、果蝇及人等几乎所有真核生物中；RNAi能高效的特异阻断基因的表达，在线虫和果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果 RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。 siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 Dicer (DCR）：是RNAase Ⅲ家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。 MicroRNA (miRNA）：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。 RNAi具有的特征 　 ①RNAi是转录后水平的基因沉默机制； ②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA； 　　 ③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的； ④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点； 　　 ⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡； 　　 ⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。 所以RNAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展，还有可能设计出RNAi芯片，高通量地筛选药物靶基，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能。 RNAi研究的一般技术路线 植物RNAi设计要点 在网站 /Blast.cgi 对编码区cDNA 进行序列比对，选择与其他基因无同源性的外显子区段。 确定拟干扰的外显子区段，大小 100-300bp，设计合适的引物扩增区段，两头各加两个酶切位点。 用 KpnⅠ和 BamHⅠ酶切回收外显子区段1。将此区段连于载体上。 用 SpeⅠ和 SacⅠ酶切回收外显子区段2。将此区段连于载体上。 文献检索 /pubmed/ 基因和蛋白同源性比较 /Blast.cgi 蛋白质组学和蛋白修饰 / 基因组学 / 基因芯片http://www.ebi.ac.uk/microarray/ 蛋白质结构 /pdb/home/home.do MicroRNA或siRNA http://www.mirz.unibas.ch/smiRNAdb/cgi/smiRNAdb?page=home 基因表达 http://www.cleanex.isb-sib.ch/ 真核启动子 http://www.epd.isb-sib.ch/ 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 RNA干扰效率的检测（体外） 一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。 LOGO RNAi技术 主讲人：方中明 component of ribosome template of protein synthesis transfer amino acid premature mRNA participate the splicing and transfer of hnRNA, in