小儿神经母细胞瘤Nmyc基因检测及临床意义.doc

小儿神经母细胞瘤N-myc基因检测及临床意义 f临床小儿外科杂志2007年8月第6卷第4期JournalofClinicalPediatricSuery,August2007,Vo1.6,No.4 小儿神经母细胞瘤N-myc基因IJ及临床意义 胡超综述杨体泉审校 神经母细胞瘤fneuroblastoma,NB)是常见的 好发于幼儿期的交感或副交感神经节的异质性恶性 实体肿瘤,占幼儿恶性肿瘤的8%～10%,其发病 率为0.3～5.5/l0万,仅低于白血病和中枢神经系 统肿瘤….60%的病例为2岁以下,96%的病例发生 在l0岁以前I.目前研究认为,NB分化是一个多种 基因参与的复杂过程.细胞形态分化中许多癌基因 的表达调控发生相应的改变I31.许多研究证实,N— myc基因扩增和过度表达与NB的浸润,转移和不 良预后密切相关N—myc基因扩增每单倍基因组gt; l0个拷贝被认为是NB预后不良的标志,N—myc基 因扩增的分析为评估NB临床进展和肿瘤治疗方案 的选择提供分子生物学信息『”l.因而早期行肿瘤组 织活检进行原癌N—myc基因检测,不仅对估计NB 预后和指导治疗具有重要意义,而且有助于进一步 探讨N—myc基因调节机制和N—myc基因在临床治 疗中的作用.本文就N—myc基因检测方法及扩增的 临床意义综述如下. 一 ,N—myc基因检测的方法 l,荧光原位杂交(FISH)技术将病理组织按常规 技术处理,取4Hm厚切片于APEC防脱片上,装入 铁染色框60%放置24h,二甲苯梯度脱蜡,酒精梯 度水化.将玻片放入高压锅加l000ml蒸馏水加热 至沸腾,冷却后放入立式缸中,倒入配好的胃蛋白酶 消化液50ml,加盖放入37温箱内25min,倒去消 化液,用蒸馏水冲洗3次,取出玻片,酒精梯度脱水 后晾干,用玻璃笔在玻片背面面出杂交区域,在每个 杂交区域用微量移液器加0.5ul探针后盖上盖玻 片.软胶封闭后置于不锈钢温盒内,然后连不锈钢温 盒一起放入80水浴箱内25min.水浴结束后将玻 片放入不锈钢温盒内,再将温盒放入45温箱孵育 2d取出玻片用镊子将封胶及玻片一起撕去,梯度 洗脱液3缸,去除非特异性背景,剩余杂交探针,滴 作者单位:广两医科大学第一附属医院小儿外科(南宁. 530021). ? 综述? 加甘油盖玻片后即可在荧光显微镜上观察.根据荧 光信号的量来确定N—myc基因是否扩增(有些步骤 可根据情况适当变化). 2,Southern印迹杂交检测N—myc基因室温下 将电泳后的琼脂糖凝胶(上有经限制性内切酶消化 的肿瘤细胞DNA片段)浸入500ml溶液A(溶液A: 5MNaC1300ml,l0MNa0H50ml,H2O650m1) 中.摇动30min后.换500ml新鲜溶液A再摇30 min.使DNA双链碱基变性.为使凝胶重新回到中 性,换入溶液B(溶液B:10M乙酸铵200ml,10M NaOH4ml,H,O1796.1m1)中重复上述过程.于料 盒或盘中放一玻璃板支架,倒入10×SSC,将 Whatman3MM滤纸放在玻璃板上,两头浸在液体 中,用玻棒赶除气泡.小心地将琼脂糖凝胶翻过(扣 过来)滑到纸上,放平,赶除气泡.将预先浸于溶液B 中的NC膜(硝酸纤维素薄膜)平铺在胶上,用玻棒 赶除气泡.在膜上放置两层预先以10×SSC浸湿的 Whatman3MM滤纸再放6张干燥吸水纸及4堆 3cm厚的折叠吸水纸.在纸上覆盖玻璃平板,板上 可置约250g重物,下部缓冲液根据虹吸原理能被 吸上来,凝胶上的单链DNA即可被吸并转移到 NC膜上.转移(24h)完成后,将胶与膜取,通过样 品槽标明记号,并剪去膜的一角,以识别方向,此时 膜与胶正面观察的方向是一致的.去掉胶,令膜稍加 十燥,用圆珠笔标号.用3MM滤膜包好,80烘烤 2h即可用于分子杂交.将膜在6×SSC中浸泡几分 钟,放入塑料袋,按0.2ml/cm膜面积加入预杂交 液,排净气泡封闭袋口,在68水浴中振动预杂交2 ～ 4h.取出塑料袋,在一角切一缺口,倒预杂交液, 按50l/cm膜面积加入杂交液,排净气泡,封口, 再于68水浴中振动杂交,杂交l2～16h.杂交结 束后取出塑料袋,剪开边缘,迅速将膜转到2×SSC 和0.5%EDTA溶液中室温下洗涤(振荡)5min,再将 膜转移入2×SSC和0.1%SDS溶液中洗涤15min, 然后将膜浸入0.1倍SSC和0.5%SDS溶液中68 振荡洗涤2h,换同样溶液再洗涤30min取出滤膜 临床小儿外科杂志2007年8月第6卷第4期JournalofClinicalPediatricSurgery,August2007,Vo1.6,No.4 在Whatman滤纸上晾干,放入塑料袋或用塑料纸包 好.在暗室中将X光片与滤膜接触,封于曝光夹中