液相色谱基础知识2.ppt

液相色谱基础知识 一、色谱起源 液相色谱按两相极性不同分为: 正相色谱 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序 液相色谱流程图 流动相 流动相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 流动相配制时的顺序 溶剂前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 过滤膜种类 水系过滤膜 有机系过滤膜 溶剂前处理 脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动 输液泵 输液泵控制方式： 恒流控制 恒压控制 岛津VP系列输液泵 进样器 自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入 柱温箱 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 色谱柱 1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5 流动相注意点 离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用 LC检测器 紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD） 紫外可见检测器 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感 2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质 岛津VP系列紫外检测器功能 1）设定时间程序（波长切换等） 2）双波长检测 3）比例色谱，初步判断峰的纯度 4）停泵扫描，确定组分最大吸收波长 二极管阵列检测器（SPD－M10AVP） 二十一世纪标准紫外检测器 色谱信息： 保留时间 常规紫外检测器 紫外光谱 二极管阵列检测器 二极管阵列检测器的优点 1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 检测器 原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定 试样各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点：1）对温度和压力变化敏感 2）不能用于梯度分析 荧光检测器 原理: 基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 缺点: 仅适用于测定可产生荧光的物质 优点: 1) 灵敏度极高,是最灵敏的检测器之一 2) 选择性好 3) 对温度和流速不敏感,可用于梯度洗脱 可检测物质: 多环芳烃,霉菌毒素,酪氨酸,色氨酸,儿茶酚氨等(具有对称共轭体系) 数据处理 岛津液相色谱数据处理单元： LC-Solution色谱工作站 CLASS-VP色谱工作站 C－R7A色谱数据处理机 C－R8A色谱数据处理机 手动进样器的原理图 装填状态 进样状态 返回 进样体积 检测器响应值 定量管体积的一半 3倍定量管体积 全量注入 部分注入 进样体积与响应值关系 返回 柱温控制的优点： 返回 ODS柱的使用注意点： 紫外可见检测器 样品池 参比池 光电管 光电管 Ein Ein Ein 光栅 D2 / W 灯 l Eout 紫外可见检测器 NEXT 波长切换 返回 双波长检测 返回 比例色谱 280nm 220 nm ratio 280/220 返回 波长扫描 返回 样品池 二极管阵列（512个单元） 光栅 D2 / W灯 每一单元可检测一个 波长下的吸光度 二极管阵列检测器 三维谱图 时间 波长 吸光度 色谱 光谱 NEXT 峰纯度检验（3点光谱图比较） Initial detection point Final detection point T1 T3 T2 peak top up slope down slope 1/2 1/3 乙酰水杨酸 下降点 上升点, 顶点 峰纯度检验（3点光谱图比较） 返回 光谱库检索 返回 示差折光检测器 返回 糖的色谱图 Analytical Conditions Column : Shim-pack CLC-NH2 Mobile phase : Acetonitrile / w