实验三、蛋白质的盐析分离和凝胶层析-曹志贱.ppt

蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐 蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）； 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解等）； 蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂）； 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离）； 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、HPLC）； 鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG，琼脂，淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）； 含量测定（fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法）。 蛋白质的盐析 凝胶层析 大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 凝胶层析载体 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。使用最多的是交联葡聚糖。 交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通过交联剂1—氯代—2，3—环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型号，后面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越大。 SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300μm，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子从内水体积流出。 注意事项 蛋白质洗脱曲线记录方式 用醋酸钡检测溶液中的硫酸根离子。 灵敏度高，与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀。同时不能同蛋白质形成沉淀。 实验中要设对照，即加入双蒸水和醋酸钡检测溶液。 为什么不用氯化钡？因为氯化钡易同蛋白质形成沉淀。 记录结果： 思考题 蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些是变性了？哪些没有变性？在分离蛋白质时常使用哪些方法？ 柱层析有哪些种类？其分离物质的基本原理？ * * 实验三 (1)了解蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术；(2)学习蛋白质的盐析分级分离原理； (3)学习蛋白质凝胶层析分离原理。 【实验目的与要求】 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。 【实验原理】 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 【实验内容与操作】 1、蛋白质（卵球蛋白）的盐析分级分离； 2、蛋白质（卵球蛋白） SephadexG-25脱盐； 3、ＵＶ检测蛋白质； 4、盐离子的检测。 1、蛋白质（卵球蛋白）的盐析分级分离 2、蛋白质（卵球蛋白） SephadexG-25脱盐 2.5ml 10管 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中； 样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加样体积通常为凝胶柱床体积的1%-10%； 洗脱用的液体与凝胶溶涨和凝胶平衡时所用的一样； 洗脱速度要恒定； 凝胶暂时不用时，要加防腐剂（如0.02%叠氮化钠溶液）； 再次使用凝胶时可再生后使用。 3、ＵＶ检测蛋白质 - 9 - 8 - 7 + 6 ++ 5 +++ 4 - 2 + 3 - 1 4、盐离子的检测