蛋白组学方法介绍.pptx

定量蛋白质组学张大伟天津工业生物技术研究所 zhang_dw@tib.cas.cn;蛋白样品制备 双向凝胶电泳 同位素标记技术（ICAT，iTRAQ，15N，SILAC） 无标记蛋白组学定量技术 定向蛋白质组学;蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。 ; 基本原则： （1）全息性（keep all of protein information），尽可能的制备所有蛋白； （2）样品制备的方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹配，如采用双向电泳，需要谨慎使用SDS抽提蛋白质；如果用液相色谱分离，不应该用太多的去污剂和两性电解质(considering following protocols/kits ) ； （3）由于样品来源千差万别，针对不同来源的样品（如细胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等），需要采取不同的蛋白质抽提方法 (Different samples, different extraction) 。 ;1）温和裂解方法 (细胞,血细胞, 细菌) 渗透裂解（Osmotic lysis） 冻融裂解(Freeze-thaw or osmotic lysis) 去污剂裂解 (Detergent lysis, SDS) 酶裂解 (Enzymatic lysis，溶菌酶, 纤维素酶, 果胶酶, 溶细胞酶);2）剧烈裂解方法 (固体组织, 酵母菌) 超声裂解法 (Sonication) 弗氏压碎器（French press pressure cell） 研磨法（Grinding，mortar and pestle) 机械匀浆法（Mechanical homogenization） 玻璃珠匀浆法 ;超声波细胞粉碎仪是一种实验室较常见的仪器，它利用强超声在液体中产生空化效应，对物质进行超声处理的多功能、多用途的仪器，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡、清洗及加速化学反应等等。 ; 原理；它用马达驱动钢体内活塞产生40000psi的压力。 加压样品悬浮液体积高达35ml，以1ml/min的速率穿过针阀。压榨池的内压随着压榨机的压力增大而增大。同时细胞内压力也增加。当样品经过样品出口管时，细胞壁外部压力迅速下降至大气压。细胞内的压力也在降低但是没有细胞外压力下降的快。压力差引起细胞壁膜破裂，释放出细胞内的物质。 该压榨机用来破坏样品细胞壁而将细胞核保留完整。 ;研磨原理：通过不锈钢小珠在样品管内来回震荡实现样本的粉碎。可适用于多种样本：包括植物样本、动物样本、细菌和酵母样本。;离液剂(Chaotropic agent): change and destroy the hydrogen bond, denaturalize protein and de-active the protein-enzyme (尿素和硫脲, Thiourea and urea). 还原剂(Reducing agent): break disulfur band formed by Cys (DTT, DTE, TBP)，increase the solubility of protein. 去污剂 (Detergent): 破坏分子之间的疏水相互作用，increase the solubility of protein. (SDS, TritonX-100, CHAPS). 两性电解质载体(Ampholyte): increase the solubility of protein.;样品制备中的离液剂（chaotropic agent）;　　蛋白质的二硫键通常用DTT或β-巯基乙醇等含自由巯基的试剂还原，但是容易导致蛋白质电泳过程中溶解性丧失； 常用的还原剂有：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇 (DTT)或二硫赤藓糖醇（DTE）和三丁基膦（TBP）等。 　 不带电的还原剂如三正丁基瞵取代含巯基试剂增强蛋白质溶解性．;PMSF (1mmol/L) (苯甲基磺酰氟):Most commonly used，inactivates serine and cysteine proteases AEBSF (4mmol/L) More soluble, less toxic than PMSF, but can cause charge modifications. EDTA, EGTA (1mmol/L) Inhibits metalloproteases 肽蛋白酶抑制剂（Peptide protease inhibitors）Leupeptin, pepstatin A, aprotinin, bestatin TLCK, TPCK (