大肠埃希氏菌表达非结构蛋白的纯化复性与活性检测.pdf

22 Chinese Journal of Veterinary Science and Technology 　Vol. 33 　No. 8 　2003 大肠埃希氏菌表达 FMD V 3AB 非结构 蛋白的纯化复性与活性检测 曹轶梅 , 卢曾军 , 刘在新 , 谢庆阁 ( 中国农业科学院 兰州兽医研究所 农业部病毒学重点实验室 , 甘肃 兰州 　730046) 　　摘要 : 采用超声波裂解细菌 ,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希 氏菌中表达的 FMDV 3AB 非结构蛋白进行纯化 ,经 SDSPA GE 分析 ,3AB 融合蛋白纯度达 90 %以 上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性 ,通过 Western blotting 分析 ,表明复性后的 3AB 融合蛋白能与抗 FMDV 抗体发生特异性结合。EL ISA 检测表 明 ,复性后的 3AB 融合蛋白有很好的抗原活性。 关键词 : FMDV ; 3AB 非结构蛋白 ; 纯化 ; 复性 ; 活性检测 中图分类号: S 852. 65 + 9. 6 　文献标识码 : A 　文章编号 : (2003) ( 　　口蹄疫病毒 Footandmouth disease virus , 一面 :首先 ,有利于其分离纯化 ;其次 , 以包涵体形式 ) ( ) FMDV 能引起多种动物口蹄疫 FMD 。该病在世 存在的蛋白能有效抵御大肠埃希氏菌中的蛋白酶对 界各地广泛流行 ,对动物生产及其产品的国际贸易 目的蛋白的降解。利用这一特性,可以表达一些毒 带来严重的影响 , 因而世界各国都非常重视该病的 性蛋白 ,而避免其对宿主菌的毒害。因而包涵体的 预防和控制。除发达国家以外 ,大多数发展中国家 复性就成为生物工程的重要研究课题[3 ] 。目前国 采取注射疫苗的方法控制该病的流行。因此 ,如何 内多采用离子交换与疏水层析法进行包涵体纯化, 区分自然感染动物和注射疫苗动物是 FMD 防制研 由于步骤较多,蛋白损失大 ,且在操作过程中对样品 究中亟待解决的问题[1 ] 。研究表明 ,FMDV 3AB 蛋 的要求高 ,给纯化带来一定的困难。利用固定化镍 白可以作为区分感染动物与注射疫苗动物的抗原。 离子金属螯合亲合层析进行纯化 ,具有配基简单 ,吸 Silberstein 等[2 ] 用原核表达的 3AB 蛋白作抗原 ,检 附量大 ,分离条件温和 ,通用性强等特点。笔者经多 测感染牛和免疫牛 , 结果感染牛 3AB 抗体均为阳 次重复试验分离纯化效果较好。 性 ,免疫牛 3AB 抗体均为阴性。 利用基因工程生产重组蛋白的困难之一是复 重组蛋白在大肠埃希氏菌中高水平表达时 , 易 性 ,除分子聚集之外 ,二硫键错配是导致复性率低的 使目的蛋白以不溶性蛋白的形式存在 ,聚集成无活 一个重要原因。因此 ,蛋白质重折叠的研究便成为 性的蛋白聚积物 ,给活性重组蛋白的生产带来一定 生产重组蛋白质无法回避的问题。提高重组蛋白质 困难。但表达蛋白以包涵体形式存在也有其有利的 的复性率是对生物技术领域的一次挑战。经过几十 年广泛而深入的研究 , 已有不少成功的范例,但其复 收稿日期 :