核酸分子杂交与应用课件.ppt

核酸分子杂交技术与应用;核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecular hybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。;Date;核酸分子杂交的基本原理与分类;Date;变性温度(Tm)：核酸分子热变性时，从开始变性到变性结束，是在一个很窄的温度范围内进行的，当变性进行到核酸分子解链一半时的温度，称变性温度，也称融解温度。;影响变性的因素：;影响变性的因素：;复性：变性核酸分子在合适的条件下重新形成双螺旋结构的过程称复性。热变性的DNA溶液在低于Tm值25 oC的温度下维持相当长的一段时间，则可使之恢复到天然的双链结构状态。复性的速度受以下因素影响：;3、温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；;分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下形成杂交双螺旋的过程。;核酸分子杂交分类：;液相杂交(solution hybridization)：是一种比较原始的分子杂交技术。待测分子与探针在杂交液中完成反应，利用层析方法将杂交分子与末杂交分子分开后用液闪仪进行计数或利用紫外吸收特性变化分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。;RNA酶保护分析法(RPA)：利用RNase A和RNase T1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到保护的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA 进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体，用RNase降解非杂交部分RNA后分析杂交结果。;RNA酶保护分析法的应用：;RNA酶保护分析法的主要步骤：;核酸酶S1保护分析法(nuclease S1 protection assay)：原理与RNA酶保护分析法的原理类似，核酸酶S1能专一性地降解单链DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA杂交双链。采用M13体系克隆和扩增特定基因的单链DNA片段，在合成过程中加入核素标记物，即可合成出高放射性的单链DNA探针。将探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA杂交双链。酶解后进行分析。;核酸酶S1保护分析法可用于基因转录起始位点???析及内含子剪切位点分析。;固相杂交：将欲分析的样品先结合在固相支持物上，再与探针进行杂交反应。杂交结果可用仪器或放射自显影技术分析杂交结果。;硝酸纤维素滤膜;尼龙膜：是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型，不同类型的膜上网孔大小不同。经正电荷基团修饰后与核酸的结合力更强。;菌落杂交：主要用于克隆筛选的固相杂交。;Southern印迹杂交：;杂交过程;预杂交液的配制;10mg/ml鲑鱼精DNA：超声法或用注射器通过6号针头反复抽打将DNA打断。煮沸后置－20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分钟后速置冰浴中。;膜的处理：将结合了DNA(或RNA)的硝酸纤维素膜或尼龙膜浸泡于6×SSC溶液中2分钟，使其充分湿润。;温育：将杂交袋浸入适当温度的恒温水浴中(不加甲酰胺时用68oC；加入50％甲酰胺时，恒温42oC)，温育1～2小时，也可延长至12～16小时。保温过程中应不断摇动塑料袋，以赶走盖在滤膜表面的气泡，否则这些气泡将阻碍杂交液与滤膜的接触。(如果将预杂交液加热到适当温度后再加入塑料袋内，可以减少气泡产生)。;杂交：杂交反应是单链核酸探针与待测核酸分子中的特异基因序列在一定的温度下杂交复性的过程。杂交包括以下过程：;3、打开预杂交袋弃去预杂交液，加入杂交液及变性的探针。排除气泡后重新封好口;洗膜：是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去的过程，非特异性杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定温度下，非特异性杂交体解链而被洗掉，而特异性杂交体则保留在滤膜上。杂交体的解链温度主要取决于杂交体的同源性和溶液的离子强度两个要素，同源性越高离子强度越高，杂交体的稳定性越高。;洗膜的操作如下：;3、将滤膜转移至一盛有大量0.1×SSC和0.1% SDS溶液的容器中，37oC振荡漂洗30分钟至1小时。;非放射性标记探针杂交;杂交液组成：;杂交反应的影响因素;2、高浓度双链探针的杂交：限制性内切酶标记的探针，在杂交过程中可能发生两种反应：1、与固定在膜上的靶序列杂交；2、双链探针的自身退火。双链探针的自身退火可使探针有20％～30％探针不能与靶序列发生杂交，因此尽量使用单链探针。;4、盐溶液的浓度：;酶联探针;探针的种类;探针的种类;探针的种类;探针的种类;探针的标记;探针的标记;DNase I;Date;Date;标记步骤;标记步骤;标记步骤;探针