生物化学重组dna技术.ppt

重组DNA技术Recombinant DNA technology; 主 要 内 容;第一节 重组DNA技术的定义及步骤; 基本步骤;一、 限制性核酸内切酶;三、DNA连接酶： 1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。 2. 大肠杆菌DNA连接酶 四、T4多核苷酸激酶:催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链5’末端 五、碱性磷酸酶：催化切除DNA、RNA、dNTP上5’磷酸基团;重组;第一部分 获得目的基因;第一节 目的基因的获得;1. PCR 获取目的基因 ;将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段;; 一、构建cDNA文库筛选目的基因;模板：mRNA 引物：oligo-dT 逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶 底物：dNTP 合成方向：5’ → 3’;逆转录酶;3. 构建cDNA文库; 4. 筛选目的基因;第二节 获得目的基因方法的选择原则;第二部分 重组体的构成、导入和筛选;第一节 基因克隆的载体;质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，能独立进行复制。 具备下列特点： 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。;常用质粒载体;pUC系列载体:由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点： （1）含有抗氨苄青霉素基因 Amp+和复制起始 点。 （2）含有大肠杆菌lacZ操纵子的DNA片段（lacZ’基因），与宿主细胞实现基因内互补，形成完整的β-半乳糖苷酶基因，能分解生色底物5-溴-4-氢-3-吲哚- β-D半乳糖苷, 形成蓝色菌落——蓝白斑筛选。;;（一）粘性末端连接 1. 全同源粘性末端 同一单酶切；方便，但高背景（空白载体）和双向插入 载体： 5’---G AATTC---3’ 3’---CTTAA G---5’ 目的DNA：5’G AATTC----G AATTC3’ 3’CTTAA G----CTTAA G5’ ;定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子。 ?双酶切，(1) 载体不能自连 (2) 目的DNA定向插入 ?粘-粘，粘-平 粘-粘连接效率很高 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导;（??）人工接头连接;二、连接反应的建立;第三节 重组体导入受体细胞;感受态菌的制备： 1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入 2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。;第四节 重组体的筛选与鉴定;;第五节 克隆基因的扩增和表达;表达载体： ◆克隆载体上加合适的转录和翻译调控序列及强启动子 ◆正确的阅读框架 ◆选择合适的宿主细胞 ;基因表达产物的检测—Western印迹法 1.蛋白质样品的制备： 2.电泳: 3.转移: 4.鉴定：;基因表达产物（蛋白质或肽）的分离纯化技术;谢谢！