第1314章核酸的性质及研究方法课件.ppt

增色效应(hyperchromic effect)： 单链多核苷酸的? (p) 比双螺旋结构的 (p)高，所以核酸发生变性后， ? (p) 升高约25%，此现象称为增色效应 变性DNA复性后， ? (p) 又降低，这种现象称为减色效应 四、核酸的变性、复性及杂交 （一）变性 定义：在某些理化因素作用下，核酸双螺旋区的氢键断裂，使变成单链，并不涉及共价键的断裂的过程。 因素：酸，碱：酸碱变性 加热：热变性 变性试剂如尿素、甲醛等。 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 例：变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 Tm：DNA的变性作用发生在一个相当窄的温度范围内，有一个相变的过程。通常把加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温称为DNA的熔解温度(Tm)。 变性的特点：爆发式 Tm Tm 影响Tm值的因素 （1）DNA的均一性 （2）介质中的离子强度 （3）G-C含量的影响 （二）DNA的复性 DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条彼此分开的链可重新缔合成为双螺旋构象，这一过程称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 DNA的复性 复性的动力学 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性退火温度＝Tm－25℃ ，快速冷却不能复性（淬灭）。 ★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。 ★两种浓度相同，但是来源不同的DNA，复性时间的长短与基因组的大小有关，具有很多重复序列的DNA，复性快 将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域具有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。 杂交也发生在DNA和RNA之间 （三）分子杂交与探针技术 Southern blotting： DNA印迹术: DNA-DNA杂交 Northern blotting： RNA印迹术 研究对象为mRNA,探针一般为 DNA Western blotting：蛋白质印迹术: 研究对象为蛋白质，抗原-抗体结合 常用的核酸分子杂交技术 第14章核酸的研究方法 核酸的分离、提纯与定量 核酸的超速离心 核酸的凝胶电泳 序列测定 DNA聚合酶链反应（PCR） 琼脂糖凝胶电泳 天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(agarose，约占80％)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。 一、支持物：琼脂糖凝胶 ①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不须事先处理就可进行电泳。 ②琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高。 优 点 ④电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 ③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用 二、 DNA的琼脂糖凝胶电泳 依据： DNA的相对分子质量 分子构型 凝胶的浓度 电压 在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 1．核酸分子大小 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 2．琼脂糖的浓度 1、凝胶类型 琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。 目前更多用的是水平型，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。 三、 电泳操作 2、缓冲液系统 常用的电泳缓冲液有： EDTA(pH8.0)＋ Tris-乙酸(TAE) Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 3．电泳方法 （1）凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却约30min。 （2）样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有O.25％溴酚蓝指示染料，含有10％～15％蔗糖或5％～10％甘油，以增加其比重，使样品集中。 溴酚蓝是带有负电荷的小分子有色物质，用于监测电泳的行进过程 核 酸 的 物 理 化 学 性 质 第 13 章 一 核酸的水解（糖苷键，磷酸二酯键） 二 核酸的酸碱性质（磷酸基，碱基） 三 核酸的紫外吸收（碱基） 四 核酸的变性和复性 （双螺旋结构） 一 核酸的水解 （一）酸水解： ? 嘌呤碱