第十三章基因工程的操作过程.ppt

构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等。 三、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。 农杆菌介导法植物转基因的理论基础 野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region）。 用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 农杆菌介导法：就是将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 基因枪法 粒子轰击(particle bombardment) 高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection) 基因枪轰击技术(gene gun bombardment)， 是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。 基本原理 它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。 花粉管通道法 是指在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 通过花粉管通道途径渗透进入胚囊的转基因片段就有可能被吸入受精卵细胞，并进一步地通过尚不明确的机理被整合进入受体基因组中。? 优点： 不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。 应用于任何开花植物，极大地扩大了基因工程目的基因的来源，和受体植物的范围。? 利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞进行转化，直接获得的产品即是转基因植株。 转化速度较快，转化效率可达1%左右，一般当年即可获得转基因植株。 方法简便有效，易于常规育种工作者掌握，适合于大规模的农作物遗传化。 缺点： 工作时间受自然花期限制。 在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。 由于转基因以随机的方式整合进入受体染色体基因组中，转基因工程植株的后代的遗传情况较为复杂。 操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧。 对单籽粒的小花农作物的操作难度较大，由于获得大量的转基因种子比较困难，故工作效率也较低。? 将目的基因导入动物细胞 通过卵细胞进行显微注射，将目的基因导入。 在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。 第十三章 基因工程的操作过程 基因工程操作的基本过程 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 一、目的基因的获取 已知基因的获得 目前目的基因的获取方法主要有以下2类： PCR分离法 化学合成法 未知基因的获得 直接分离法 基因文库分离法 已知基因的获得 如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与序列互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。模板可以是基因组DNA，也可以是mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。 PCR分离法 采用PCR分离目的基因省时、省力，但他一般要求待扩增的片段是已知的，至少要求DNA片段两端长约20bp的序列已知的，这样才能设计出有效的引物。 未知基因的获得 直接分离法 限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。 应用对象： 适合于从简单的基因组中分离目的基因，如质粒或病毒的大小只有几千碱基，大的也超不过几十万碱