结构生物学生物大分子解析方法.ppt

结构生物学的研究方法和技术;生物大分子要发挥功能，必须满足两个条件: 第一，凡要发挥功能和活性的生物大分子必须具有特定的，自身特有，相对稳定的三级结构; 第二，结构运动。任何的破坏促使没有稳定的三级结构和结构运动，生物大分子是很难发挥生物功能或活性的。 ;结构生物学概念及主要研究方法;结构生物学的发展;60-70年代,在同一实验室的他们又发展了电子晶体学技术，当时的研究对象主要是有序的,对称性高的生物体系，如二维的晶体和对称性很高的三维晶体。 70-80年代，多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶液中研究生物大分子成为可能,水溶液中的生物大分子更接近于生理状态. 80年代到本世纪初,冷冻电子显微镜的发明,这种技术的发明使我们不仅能够研究生物大分子在晶体状态和溶液状态的结构，而且能够研究研究复杂的大分子体系超分子体系，这就是细胞器和细胞. 可见结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶液再到大分子体系,超分子体系,如核糖体(ribosome),病毒,溶酶体(lysosome),线粒体等. ;X- 射线晶体衍射方法;X-ray测定生物大分子结构的原理;为什么要用X-射线;X-射线的波长与原子以及化学键的尺度相当，都在?的数量级。因此可以被用来探测蛋白质分子内部的结构。;为什么要用衍射;什么是晶体;Na;;如何根据衍射结果解析蛋白质结构;f(x) = A cos(2px – a);;解决相位问题的方法： ? 同晶置换法 最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据。 ? 反常散射法 包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需要引入具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常散射源。 ? 分子置换法 需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体，不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。;;;蛋白质结晶的必要条件;沉淀剂的作用;获得蛋白质晶体的方法;悬滴法;座滴法;结晶溶液;结晶条件的优化;衍射实例;缺点：样品必须为晶体（单晶）,但生物大分子结晶困难,特别是膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更是困难. 其次对于像病毒那样大的分子组装体,测量其精细结构十分复杂. 原因有二: 一是大晶胞含有的原子极多,X射线衍射点极多,常常无法区分、辨认和探测; 其二是大晶胞所产生的衍射点强度过弱,特别在高分辨时,无法与背景区分. ;NMR也是测定生物大分子结构重要手段;基本原理：核磁共振现象( nuclear magneticresonance spectroscopy ,NMR) 1946 年由哈佛大学的伯塞( E.M.Purcell) 和斯坦福大学的布洛赫(F.Bloch) 所领导的2个小组,用不同的方法在各自的实验室里观察到的,伯塞尔使用的实验方法是吸收法,而布洛赫使用的是感应法. 利用物理原理,通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质。NMR 不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法。由于不同的原子核吸收不同的电磁波，因而通过测定和分析受测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种原子，原子之间的距离有多大，并据此分析出它的三维结构。;核磁共振(NuclearMagnetic Resonance -NMR);在水溶液中,大约有一半的蛋白质链呈现出规则、紧密的三维结构 ,而另一半则非常松 。目前,科学家已经利用这一方法绘制出15 %～20 %的已知蛋白质的结构。;核磁共振方法的最大特点是可以直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间结构，其分辨率已接近012nm ,但因为大分子量的生物分子的核磁共振图谱非常复杂,难以解释,因此它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可测定35kDa 的生物分子; 其次在测定中要求样品是高纯度且数量相对较多,使样品制备亦有困难;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物样品,对膜蛋白或病毒等的组装体、复合体就无法测定.;另一种方法称为冷冻电镜计算机三维重构方法或单颗粒技术（Cryo-EM）. 特点:急速冷冻(103 -104 ℃Ps) 样品悬液,样品被包埋在无定形的非晶态冰薄膜中,这样既不损伤样品,又可使样品保持着自然状态,因而样品制备简单。 缺点：分辨率稍低. 研究的病毒样品,目前分辨率接近0.17nm ,预计这几年内可达0.14nm. 核糖体可达1.10nm ,而离子通道可达2.10nm.;由于应用冷