人教版选修一专题五《DNA和蛋白质技术》课件 （共54张PPT）.ppt

1.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、基础知识 （二）缓冲溶液 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。 1.作用: 2.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 3. 在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液, 成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？ （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 一、DNA粗提取和鉴定原理 定义： 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 1、PCR仪 ㈠.设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 二.PCR的实验操作 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。 1.准备 2.移液 ㈡.实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。 混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 3.混合 ⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 4.离心 ⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 5.反应 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94℃，10min － － 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸. PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6.注意事项 ⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头 ㈠.理论上DNA扩增数目的计算 三.课题成果评价 1.一条DNA，复制n次，DNA为2n 2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n ㈡.实验中DNA含量的测定 1.原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。 2.过程 ⑴.稀释 2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释. ⑵.对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。 取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ⑶.计算 ⑷.计算 DNA含量(?g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数 50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02 光吸收 波长／nm 260 240 220 280 0.1 0.2 比色杯