名校联盟内蒙古海拉尔三中高中生物选修一《多聚酶链式反应扩增DNA片段》课件.ppt

循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 3、30次循环后靶序列扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 二、 PCR 的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C，10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6、注意事项 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头 （一）理论上DNA扩增数目的计算 三、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 2 、过程 ①稀释 2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 ②对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ③计算 ④计算 DNA含量（ ?g ）＝50 x (260nm的读数） x 稀释倍数 50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02 比色杯 四、 课题延伸 例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点 五、实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性、复性和延伸 72℃ * * 多聚酶链式反应扩增DNA片断 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 4、多脱氧核苷酸链得形成 脱氧核苷酸结构式 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 ② RNA引物的合成 以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物 ③ DNA的生成 以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成DNA。 边解旋边复制(过程） 复制特点 半保留复制（结果）