糖皮质激素反常诱导人羊膜成纤维细胞胞浆型磷酯酶a2α表达的分子机制-生理学与生物物理学专业论文.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 复旦大学博士学位论文糖皮质激素反常诱导人羊膜成纤维细胞 复旦大学博士学位论文 糖皮质激素反常诱导人羊膜成纤维细胞 胞浆型磷脂酶A2a表达的分子机制 中文摘要 早产和过期产严重危害新生儿健康，目前尚缺乏有效的干预手段，其主 要原因在于人类分娩启动机制尚未解析。前列腺素是公认的哺乳类动物包括人 类分娩启动的最后通路。花生四烯酸是前列腺素的重要合成前体，而胞浆型磷 脂酶A2Ⅱ(cPLA2a)是负责从磷脂释放花生四烯酸最为重要的磷脂酶。人类妊娠晚 期子宫内组织大量表达cPLA2n，其中以羊膜组织表达量最高，约占整个子宫内 组织磷脂酶活性的70％左右。随孕期进展，入羊膜ePLA2Ⅱ表达量随之增加，在 分娩启动之前达到最高峰值，因此人羊膜cPLA2旺水平上升被认为是分娩启动中 的重要事件。糖皮质激素是公认的经典抑制炎症激素，在多数细胞中糖皮质激素 抑制cPLA2a表达，但是在人羊膜成纤维细胞中，糖皮质激素却反常诱导cPLA2a 表达，糖皮质激素的这一反常诱导作用被认为是人类分娩启动的关键环节之一， 但是糖皮质激素此反常诱导作用的分子机制至今仍未解析。 本研究采用对糖皮质激素具有反常反应的原代人羊膜成纤维细胞和对糖皮 质激素具有经典反应的人胎儿肺成纤维细胞株(HFL．1)为研究模型，采用实时荧 光定量PCR、Western blotting、启动子克隆与活性测定、RNA干扰和功能蛋白 过表达、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀和ELISA等实验技术，联合类固醇激素 及其受体阻断剂给药、信号通路激动剂及拮抗剂给药和蛋白酶抑制剂给药等实验 方法，通过比较糖皮质激素对两种细胞模型cPLA2。表达的不同调控，分析得到 了糖皮质激素反常诱导人羊膜成纤维细胞cPLA2。表达的一些关键因素。冀希望 通过此研究为解析人类分娩启动机制和l临床干预早产以及过期妊娠提供新的思 路。主要实验结果如下： 1．实时荧光定量PCR和Western blotting实验表明，皮质醇(0．01．1}tM)呈 剂量依赖性反常诱导入羊膜成纤维细胞cPLAz。表达，该诱导作用与皮质醇对 HFL一1细胞cPLA2。表达的经典抑制作用形成鲜明对比。 复旦人学博十学位论史2 复旦人学博十学位论史 2．采用实时荧光定量PCR和Western blotting实验发现，皮质醇(1pM)对人 羊膜成纤维细胞cPLA2Ⅱ表达的诱导作用被糖皮质激素受体(GR)拮抗剂RU486 (1izM)、mRNA转录抑制剂DRB(75¨M)和蛋白质合成抑制剂CIIX(101aM)gJtg昕， 提示皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA如表达的诱导作用需要糖皮质激素受体 (GR)参与介导，该作用发生在转录水平，此外，该作用还需要合成其他蛋白 参与。 3。实时荧光定量PCR和Western blotting实验发现，皮质醇(0．01一lpM)剂 量依赖性抑制包括白细胞介素1D、肿瘤坏死因子Ct和白细胞介素6三种早产相 关的重要促炎症细胞因子mRNA的表达；此外，皮质醇(1pM)能够正常诱导人 羊膜成纤维细胞NFrJ3抑制因子一IKBq的表达。}：述实验结果提示，皮质醇对人 羊膜成纤维细胞NFr,B炎症通路和上述促炎性细胞因子的经典抑炎作用没有发 生异常，皮质醇无法通过反常激活上述炎症通路来参与对人羊膜成纤维细胞 cPLA2a表达的上调作用。 4．ELISA、常规PCR和Western blotting实验发现，原代人羊膜成纤维细胞 本身能够合成分泌少量孕激素；而且，该细胞表达的孕激素受体以A亚型(PRA) 为主，基本不表达B亚型。免疫共沉淀实验、siRNA基因沉默和PRA过表达实 验发现．人羊膜成纤维细胞内源性孕激素能够激活自身的PRA，PRA进一步与 GR形成异源二聚体，削弱GR的转录功能，从而削弱皮质醇对人羊膜成纤维细 胞cPLA2吐表达的诱导作用。此外，采用外源性孕激素模拟人类妊娠晚期高浓度 孕激素环境对皮质醇功能影响的实验发现，孕激素本身对人羊膜成纤维细胞 cPLA2班基础表达无明显作用，但是当孕激素浓度高m皮质醇浓度10倍以上时。 孕激素显著性削弱皮质醇对cPLA2n的诱导作用。上述实验结果表明，人羊膜成 纤维细胞表达的PRA不利于皮质醇功能的发挥，而且，人类妊娠晚期所特有并 区别于其他多数哺乳动物的高浓度孕激素环境也不利于皮质醇功能的发挥，因 此，皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2。的诱导作用与上述高浓度孕激素环境无 关。 5．将cPLA2Ⅱ启动子克隆并构建进入报告基因质粒，转染细胞后测定启动子 复q 复q人学博士学位论文 活性发现。皮质醇促进人羊膜成纤维细胞一595bp cPLA2Ⅱ启动子活性，表明介导 皮质醇反常诱导cPLA2位的关键序列位于该595bp序列之内。采用PCR克隆