小鼠成熟精子中trna裂解与dnmt2的关系-基础兽医学专业论文.docx

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文4．3．1小鼠各组织及精子中DNMT2蛋白的定位表达．324．3．2小鼠卵巢中DNMT2蛋白的表达特征。354．3．3猪的成熟精子和部分组织中DNMT2蛋白的表达．354．3．4小鼠精子及各组织中DNMT2蛋白水平的表达特征．374．4DNMT2转录水平的定位表达特征．．384．4．1DNMT2转录水平的表达384．4．2DNMT2转录水平的表达定位394．5小鼠精子DNA的m5C修饰的检测．405讨论z125．1小鼠成熟精子获取的关键445．2提取小鼠成熟精子蛋白质和tRNA的探讨．445．3DNMT2的DNA甲基化修饰456结论46参考文献47致谢57II万方数据小鼠成熟精子中tRNA裂解与DNMT2的关系摘要tRNA在机体蛋白质合成过程中发挥重要作用。此外，tRNA还参与反转录、蛋白质降解和细胞通讯等过程。研究表明tRNA可在应激状态下被剪切，但在生理状态下小鼠成熟精子中也存在大量tRNA片段，这些tRNA片段生成的分子机制尚不清楚。通过分析成熟小鼠精子中这些小片段来源的tRNAs序列，我们发现它们大多是DNA甲基转移酶2(DNMT2)的底物。DNMT2主要甲基化tRNA反密码子环的38位胞嘧啶的第5位C原子产生m5C，此修饰可防止tRNA在应激状态下被剪切。本研究旨在探讨小鼠成熟精子中tRNA片段的生成与DNMT2的关系。具体内容如下：1．小鼠成熟精子tRNA稳定性检测从小鼠的睾丸、肝脏以及成熟的精子中同时提取总tRNA，通过Northern blot检测tRNA．Asp、tRNA．Gly和tRNA．Glu的稳定性。结果表明：与小鼠肝脏和睾丸相比，三种tRNAs在小鼠精子中的降解程度更高，与文献报道小鼠成熟精子中存在大量的tRNA小片段相一致。2．DNMT2蛋白定位及表达特征的检测采用免疫组化技术检测小鼠各脏器和精子中DNMT2蛋白的表达，并进一步在猪的部分脏器和精子中验证，发现小鼠和猪的心、肝、脾、肺和肾中有DNMT2蛋白表达，但小鼠睾丸与附睾中的精子及猪精子中检测不到DNMT2蛋白。随后从小鼠各脏器和成熟精子提取总蛋白，采用Westernblot检测DNMT2蛋白，结果表明小鼠上述各组织中均表达DNMT2蛋白，但成熟精子则不表达中DNMT2。3．DNMT2的mRNA检测TRiZol法同时提取小鼠肝脏和成熟精子的总RNA，反转录成cDNA，以小鼠13-actin作为内参，设计D．actin和DNMT2引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测发现：内参均存在的情况下，DNMT2目的片段条带在肝的PCR产物中能检测到，但在精子中则不能。进一步利用生物素标记的探针对小鼠肝脏与睾丸切片中DNMT2的mRNA进行原位杂交检测，得到与PCR扩增一致的结果，说明在小鼠成熟精子中，DNMT2在转录水平就已经缺失。万方数据华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文4．小鼠成熟精子DNA的m5C检测利用小鼠DNA的m5C抗体，通过免疫组化检测睾丸组织中的m5C修饰水平，发现DNA的m5C修饰随精子发生过程呈现递减趋势，在成熟精子中则完全消失，该结果与DNMT2蛋白在睾丸中的表达特征相一致。结论：在小鼠成熟精子中，tRNA降解程度较其他组织高，DNMT2在成熟精子中转录与蛋白水平均缺失。由于DNMT2的功能是甲基化tRNA防止tRNA被剪切，本论文研究结果说明：小鼠成熟精子中缺少DNMT2，导致tRNA更容易被剪切，从而产生tRNA片段。本论文的研究结果为精子发生的分子机制提供了更多的信息，详细分子机制还有待深入研究。关键词：DNMT2；tRNA；rn5C；精子万方数据小鼠成熟精子中tRNA裂解与DNMT2的关系Abs仃acttRNAplaysakeyroleinproteinsynthesis．Inadditiontoitscanonicalfunctioninproteinbiosynthesis，tRNAalsoparticipatesinreversetranscription，proteindegradationandeellcommunication．Understresscondtion，tRNACanbecleaved．tRNAderivedfragmentswerefoundenrichedin maturemousesperms．Nevertheless，itisunclearwhythesefragmentswereproducedinspermsunderanormalphysiologicalcondition．BioinformaticanalysisdoneinOUrgrouprevealedthatthesefragmentsaremo