小g蛋白rac1及其上游调控分子ocrl1在骨关节炎疾病发展及治疗中的作用研究-运动系统的修复与再生专业论文.docx

浙江大学博士学位论文致谢致谢衷心感谢我的导师欧阳宏伟教授在本人博士期间对我的指导和帮助。本课题从选题、设计到论文的撰写、修改、校审，都是在欧阳老师的悉心指导下完成的。欧阳教授追求理想，追求卓越，乐观积极的精神品质深深影响了我。博士期间欧阳教授鼓励、激发我像研究者一样独立思考，修炼研究者必备的“七剑”：批判性阅读文献，提出问题和假设，触类旁通地设计解决方案，高质量执行实验，讨论分析和书写论文投稿，演讲推介以及写标书获得资源的能力。博士第四年，有幸得到留学基金委的资助，出访美国约翰霍普金斯大学医学院进行交流学习，欧阳教授选择了“掌心向上”的同意支持我进行博士第4、5年的出国学习，让我非常感动。欧阳教授对科研敏锐、独到的洞察力，大胆假设和创新的意识和人格魅力是我不断学习的榜样。感谢周以诞教授、纪峻峰教授、胡虎教授、吴希美教授对本研究课题的指导；感谢邹晓晖教授、章淑芳副教授、柳华副教授、陈晓副教授、姜洋子博士、张薇博士、陈佳林博士、赵洪石博士、茵梓博士、周婧博士、沈炜亮博士对本研究工作的帮助；特别感谢陆平博士、刘欢欢博士、吴岩博士、戴俊、陈鹏飞、孙亨、张小磊、夏青青、俞冬升、蔡友治、陶家栋、王权、熊思、汪艳燕等在课题完成过程中的鼎力协助；感谢张璨、朱汀、杨龙、任浩、蔡红霞、牟琴、吴兵兵、谢玲玲、施丽冰、王俊娟、王亚菲、张显著、赵海燕、胡嘉洁、从晓霞、郑泽峰等实验室成员对实验室平台的维护和管理；感谢电镜平台王贝贝老师、王丽老师、杨平老师、陈汉民老师在电镜工作中的帮助；感谢医学院公共技术支持平台工作人员的帮助；感谢医学院动物房工作人员的帮助；感谢实验动物们所作出的贡献和牺牲。感谢父母和家人一直以来给予我的关心、爱护和支持。衷心感谢所有帮助过我、关心过我的人!愿你们平安、快乐、幸福!万方数据浙江大学博士学位论文中文摘要小G蛋白Racl及其上游调控分子OCRLl在骨关节炎疾病发展及治疗中的作用研究博士研究生：朱守安导师：欧阳宏伟中文摘要第一部分：Racl在软骨细胞肥大钙化及骨关节炎病理中的作用研究目前一种普遍认同的理论认为，在骨关节炎(Osteoarthritis，OA)的发生过程中，关节表面软骨细胞发生了类似于软骨发育中的软骨内成骨(EndochondralOssification)过程，导致了软骨细胞的病理性肥大、钙化(Hypertrophy andCalcification)，最后导致软骨层遭到破坏。Racl(ras。RelatedC3BotulinumToxinSubstrate1)是乌苷三磷酸酶(guanosinetriposphatase，GTP)家族中的重要成员，具有Rho类型的GTP酶结合区，与GTP和二磷酸乌嘌呤核苷(guanosinediphosphate，GDP)有高度亲和性，与GDP结合时失活，与GTP结合时激活。在C57小鼠的软骨中特异性敲除Racl，会导致软骨内成骨过程受阻，肢体发育变短；体外软骨细胞中，Racl的过度表达会促进软骨细胞肥大标志COLXpromoter的活性升高，提示Racl在软骨发育过程中有促进软骨细胞肥大、钙化的作用。然而，Racl在软骨细胞的病理性肥大、钙化作用，以及骨关节炎疾病发展中作用的研究仍然较为缺乏。本研究首次检测了OA软骨样本及正常软骨样本中Racl总表达量、活性的区别。我们首先发现，OA软骨中Racl活性异常升高，提示Racl可能参与OA疾病的发展。为了验证Racl在OA中的作用，我们通过前交叉韧带和半月板切除术(ACLT)构建了小鼠OA模型，同时构建了Racl过度激活和Racl失活两种病毒载体，体外包装病毒并浓缩，通过关节腔注射病毒浓缩液改变关节软骨局部RaclTT万方数据浙江大学博士学位论文中文摘要活性。术后8周对软骨的组织学检测发现，Racl活性升高显著促进软骨基质降解，促进基质降解酶MMPl3、ADAMTS．5的分泌以及软骨肥大钙化标志COLX和Runx2的表达。反之，降低Racl的活性显著减缓OA的发生。体外的机制研究表明，Racl激活能够促进软骨细胞病理性的肥大、钙化，而这种作用是通过促进p-catenin核内转运介导的。关键词：Racl，NSC23766，软骨肥大钙化，骨关节炎第二部分：Racl上游调控因子RhoGAPOCRLl在调控Racl活性及软骨钙化中的作用研究第一部分研究已经发现OA软骨细胞中Racl的活性异常升高，由于Racl属于小G蛋白家族，其活性的高低受细胞内一些专门的上游调控因子调控。如鸟苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)能够提高小G蛋白活性，GTP酶活化蛋白(GTPaseactivatingprotein，GAP)能够降低小G蛋白活性。因此，我们推测软骨中某些GEF的上调或者某些GAP的下调导致了R