细胞周期蛋白cdc50a参与维持卵巢癌干细胞特性及其相关作用机制的研究-妇科专业论文.docx

北京协和医院博士毕业论文中文摘要研究背景卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发生率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，居第三位，然而其致死率高居首位。卵巢癌起病隐匿，大多数患者诊断时己为晚期。在过去的几十年中，对卵巢癌患者的基本治疗方案采取理想的肿瘤细胞减灭术辅助铂类药物为主的联合化疗，虽然取得了一定的疗效，但是仍有70％左右的患者在18个月内复发，晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为30％。目前认为肿瘤的耐药及复发是造成卵巢癌高死亡率的主要原因，但是卵巢癌耐药及复发的机制目前仍不清楚，故而严重阻碍了卵巢癌的有效治疗。自上世纪来，肿瘤干细胞(Cancerstemcells，CSCs)理论被提出，认为肿瘤组织中存在少量的干细胞，是导致肿瘤进展、复发及化疗耐药的根源。Bonnet和Dick 从白血病患者中分离出CD34+CD38’细胞被证实具有干细胞特性，这是世界上首次发现CSCs的存在。之后大量研究相继发现多种实体肿瘤中也存在极少量的CSCs，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等。研究表明，CSCs具有分化、自我更新等类似正常干细胞的生物学特性，同时具有致瘤能力且对化疗药物产生耐药性。目前肿瘤干细胞的研究取得了很大的进展，在一些实体肿瘤中已建立了一系列CSCs分离、鉴定的方法，对肿瘤发生、进展、耐药和复发的机制的研究以及探索肿瘤治疗的新领域具有重要意义。近年来，CSCs理论被应用于卵巢癌的研究中取得了一定的成绩。但是，目前对于卵巢癌干细胞的研究仍在借鉴其他实体肿瘤的方法，如对卵巢癌干细胞的识别缺乏较为特异的标记物，目前使用较多的标记物有CDl33、CDll7、CD44、ALDHl、EPCAM等，其中CD44被作为乳腺癌、胰腺癌等CSCs的标记物，CDl33被作为结肠癌等CSCs的标记物等。其分离获得的方法仍主要依靠SP细胞的分选。因此，寻找特异性的表面标记物，对于卵巢癌干细胞的研究极其重要，对探索卵巢癌新的治疗方法具有重大意义。本课题前期工作中利用稳定同位素标记及质谱为基础的蛋白质组学技术分析比较卵巢癌细胞系SP和非SP细胞膜蛋白的差异表达，筛选出一种跨膜蛋白30A(transmembraneprotein30A，TMEM30A)，又称细胞周期蛋白50A(celldivisioncycle50A，CDC50A)，并通过大量体内外实验对卵巢癌细胞系及原代卵巢癌细胞CDC50A+细胞进行鉴定，证实其具有CSCs生物学特性，是CDC50A有望成为卵巢癌干细胞较为特异的表面标记物。本研究承接前期工作，对CDC50A参与维持卵巢癌干细胞特性及其相关作用机制做进一步研究。研究方法万方数据北京协和医院博士毕业论文1。构建CDC50A+细胞比例下调的SKOV3细胞。用4段CDC50AshRNA转染293T细胞，运用Westemblot方法筛选能有效下调CDC50A基因表达的shRNA，包装慢病毒载体，并利用通过慢病毒感染技术，下调卵巢癌细胞系SKOV3中CDC50A+细胞比例，利用流式细胞学方法检测其下调效率。利用流式分选仪分选得到CDC50A+细胞比例下调组(SKOV3 CDC50A．GFP)细胞和阴性对照组(SKOV3NC．GFP)细胞。采用流式细胞学方法检测SKOV3 CDC50A．GFP及SKOV3 NC-GFP中CDC50A的表达水平。2．CDC50A+细胞比例下调的SKOV3细胞干细胞特性的鉴定。利用含血清的HG．DMEM培养基体外培养，验证SKOV3CDC50A．GFP及SKOV3NC．GFP细胞的分化能力。利用无血清悬浮培养方法，检测SKOV3CDC50A．GFP及SKOV3NC．GFP细胞sphere形成能力及传代能力，并运用流式细胞学方法验证sphere对CDC50A的富集作用。MTT法检测SKOV3 CDC50A．GFP和NC．GFP细胞对顺铂的耐药性。将SKOV3 CDC50A．GFP和NC．GFP细胞等量接种于NSG小鼠皮下，观察成瘤情况，检测其成瘤能力。3．人卵巢癌CDC50A+和CDC50A-细胞RNA测序及其与干细胞功能相关的机制分析。收集3例卵巢癌患者肿瘤组织，分离得到卵巢癌细胞，利用流式细胞分选仪分选获得CDC50A+和CDC50A-细胞，分别提取两组细胞RNA，进行RNA测序。获得两组细胞的差异表达基因，并对其进行功能分析和相关信号通路的富集分析。研究结果1．成功构建CDC50A+细胞比例下调的SKOV3细胞。Western方法检测转染4段CDC50AshI斟A的293T细胞的CDC50A表达，序列TMEM30A．homo．974沉默CDC50A基因的效率最高，其靶序列为GCCTGTGAACTGGCTTA AACC。将其包装慢病毒载体后，感染293T细胞，Western法检测其能使CDC50A表达降低80％