植物原生质体细胞骨架观察和兰花病毒的检测技术-植物病理学专业论文.docx

浙江大学硕上学位论文摘要蚕豆萎蔫病毒2(Bean broadwilt virus 2，BBWV 2)发生广泛，对许多经济作 物造成严重危害。为了建立研究BBWV 2与寄主植物互作关系的实验体系，本文以 防虫温室培育20～60d的豌豆幼嫩叶片为材料，进行了豌豆原生质体的分离培养研究，并对酶液配比、酶液pH、酶解时间、渗透压调节条件等作了探索。分离出的原 生质体形态饱满浑圆，FDA测定活力良好。采用B微管蛋白一抗(鼠抗)和荧光基 团FITC标记的兔抗鼠二抗标记感染BBWV 2和健康的豌豆原生质体微管骨架，用 激光共聚焦显微镜进行了观察。用产自新鲜活体叶片的原生质体替代产自愈伤组织的原生质体，研究BBWV 2与寄主之间的互作，更接近事实原貌。研究中并未观察 到感染BBWV2后寄主细胞骨架的特异变化，可能病毒感染不造成寄主细胞骨架的 变化，或者变化较小不易观察。建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)和齿兰环斑病毒 (Odontoglossum ringspot virus，ORSV)在兰花上大面积严重发生，对兰花的经济和观 赏价值造成了不可估量的损失。本文研究了兰花上两种主要病毒的检测方法，并对 其灵敏度及田间检测实用性进行比较。 ．应用I-ELISA方法和电镜负染法对采自杭州、北京等地区多品系兰花上的 CymMV和ORSV进行了检测，并分析比较了I-ELISA，DAS．ELISA和TAS．ELISA 三种方法的灵敏度。数据表明两者发病率相似皆较高，但皆有无毒品系存在，应严格控制其传播，避免无毒品系染病。分析I-ELISA和DAS．ELISA及DAS—ELISA等方法所得数据表明，TAS．ELISA在三者之中检测灵敏度最高。 7应用抗CymMV单克隆抗体建立了快速检测田间样品的免疫斑点法(Dot．ELISA)和组织印迹：；去-(Tissue blot．ELISA)，对其田间实用性进行了分析。CymMV单抗稀释 3000倍时．Dot—ELISA中病叶粗汁液可被检出的最大稀释度为l：5 120。Tissue blot．ELISA中样品一次平切后第1次印迹与Dot．ELISA样品1：40稀释的结果相当， 前4次印迹均可获得满意的显色效果。Tissue blot—ELISA的灵敏度低于Dot．ELISA， 但Tissue blot—ELISA操作方便，更适宜田间应用。关键词：原生质体：细胞骨架：建兰花叶病毒；齿兰环斑病毒；酶联免疫吸附 法；免疫斑点法；组织印迹法浙江大学硕上学位论文AbstractBean broad wilt virus 2(BBWV 2)is reported in many regions caused serious losses in economic crops．For study of virus—host—relationship about BBWV 2，the factors that affect protoplast isolation，includes enzyme，pH value of enzyme，isolation time，osmoticstabilities were studied with young and tender leaves，which came from pea that cultivated in pest proof green house for 20 to 60 days．The isolated protoplasts whose sizes were plumpness and round in size and vigor were nice determined with FDA．The protoplasts both healthy and BBWV 2 infected were marked with primary antibody of 13-Tubulin(mouse)and rabbit antihnouse IgG antiserum as second antibody and detected by laser scanning confocal microscope．It was closer tO nature that used protoplasts isolated from flesh leaves instead of callus．In results，special change was notdetected in microtubule cytoskeleton between protoplasts healthy and BBWV 2 infected，which show