新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究-微生物学专业论文.docx

IlI东大学博上学侮论文摘要随着基因工程的发展，微生物表面展示系统己发展出噬菌体展示系统、细菌 表面展示系统、酵母表面展示系统等，广泛应用在生物学研究及工业生产的许多 领域，例如研究蛋白质．蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白 质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、 开发生物传感器、开发细胞吸附剂等等，成为竞相研究的热点。但己发展的微生物表面展示系统都存在自身明显的缺陷：噬菌体展示系统展 示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影响噬菌体的装配与感染；革兰氏阴性 菌表面展示系统表达的重组蛋白易以包涵体形式存在，展示的蛋白不仅要通过质 膜层，还要在外膜上正确的整合，这可能对展示蛋白的结构和活性产生影响；革 兰氏阳性菌细胞壁厚，转化效率较低，这样会影响大容量肽库的构建；两种细菌 表面展示系统均缺乏翻译后修饰功能，容易使展示的真核蛋白失活：酿酒酵母中 虽存在蛋白质翻译后修饰，但糖基化方式与哺乳动物不同，它对外源蛋白N．糖 基化修饰形式是高甘露糖型，糖链平均为50．150甘露糖残基，并且核心寡糖末 端是Ⅱ．1，3．甘露糖，从而使生产的蛋白在人体中有比较强的免疫原性，过度糖基 化还可能使表达的酶等功能性蛋白失活。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核 表达系统。其具有易于培养、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因诱导型强启动子，可调控外源基因的表达、可对外源蛋白进行更接近高等生物的加工折叠和翻译后修 饰、便于基因工程操作和高密度发酵等的特性，成为微生物表面展示系统极有应 用前景的宿主菌。目前已有的毕赤酵母表面展示系统主要是利用来自酿酒酵母Flol蛋白的N 端絮凝结构域为锚定蛋白将外源蛋白展示于菌体表面，融合蛋白非共价连接于毕 赤酵母细胞壁上。展示的外源蛋白通过N端与锚定蛋白融合，C端蛋白游离， 这样的系统适合脂酶等活性位点在C端的功能蛋白。但对活性位点在N端的功 能蛋白表达不利，限制了更广泛的应用。为丰富毕赤酵母展示系统，展示不同需山东大学博士学位论文要的外源蛋白，本文做了以下3部分工作： 第一部分：Pirl型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究Pit(Proteins with internal repeats)系列蛋白是酿酒酵母中共价连接细胞壁的 甘露糖蛋白，C端无保守的GPI锚定序列，直接与细胞壁中pl，3．葡聚糖相连。 成熟肽蛋白N端有数目不等的重复序列，可被温和碱(30 mM NaOH，12 h，4 oc) 从细胞壁抽提。外源蛋白可通过与Pir蛋白N端融合、C端融合或插入融合展示 在菌体表面。目前Pir系列蛋白在酿酒酵母表面已成功展示了多种外源蛋白。本研究克隆了来自酿酒酵母EBYl00的Pirl蛋白成熟肽基因(尸驴J．口)，连接入 毕赤酵母分泌表达载体pPIC9Kq，，构建了新型毕赤酵母表面展示的通用载体 pPIC9K-Pirl-a。利用a．factorf言号肽将蛋白引导分泌至细胞外。通过免疫荧光分 析以C端与Pirl．a蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescence protein，EGFP)，证明新的毕赤酵母表面展示系统 的构建是成功的。但激光荧光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy， CLSM)观察到EGFP．Pirl．a融合蛋白的展示是不规则的，分析这种不规则的展示 可能与Pirl蛋白自身性质相关。进一步以Pirl成熟肽N端重复序列(Pirl．b蛋白)为锚定蛋白，构建新的毕赤酵母表面展示载体pPIC9K．Pirl．b，表面展示的模式蛋 白仍采用EGFP。CLSM观察到新的融合蛋白EGFP．Pirl．b是规则的展示在重组毕 赤酵母表面。Western blot证明了融合蛋白EGFP．Pirl．a与EGFP．Pirl．b可被温和碱 从重组毕赤酵母细胞壁抽提，并且很少分泌到培养基中。荧光分光光度计及流式细胞仪检测发现，分别以Pirl．瘌Pirl-b为锚定蛋白时，相同诱导条件下，表面展示EGFP的重组毕赤酵母菌株的荧光强度是相当的。以上结果说明酿酒酵母的Pirl 蛋白可作为毕赤酵母的锚定蛋白，将外源蛋白展示于毕赤酵母表面，融合蛋白没 有改变Pirl蛋白自身的锚定性质：同时说明了Pirl成熟肽蛋白中，其N端重复序 列对其锚定在细胞壁起主要作用，C端序列对其在表面的不规则展示起主要作 用。第二部分：a凝集素型毕赤酵母表面展示系统的构建及毕赤酵母表达重组蛋白纯化新方法的探讨a凝集素是是酿酒酵母中共价连接细胞壁的GPI(Glycosyl phosphatidylⅡIIJ东大学博士学何论文inosit01)型甘露糖蛋白的一种，C端有GPI锚定序列，并通过