载基因固体脂质纳米粒的研究-药剂学专业论文.docx

山东大学硕士学位论文符号说明pEGFPPlasmidenhancedgreenfluorescentprotein增强型绿色荧光蛋白基因PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液SDStandarddeviation标准差RSDRelativestandarddeviation相对标准偏差SLNSolidlipidnanoparticles固体脂质纳米粒CTABcetyllrimethylammoniumbromide十六烷基三乙基溴化铵pDNAPlasmidDNA质粒DNADDSdrugdeliverysystems给药系统CCK．8CellCountingKit-8细胞计数试剂盒TrisTri(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷RAccumulativerelease累积释放百分率rCorrelationtoefficient相关系数CDCirculardichroism圆二色谱TEMTransmissionelectronmicroscopy透射电子显微镜PLGApoly(1actic—CO—glycolicacid)聚乳酸．羟基乙酸共聚物18原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：坠j墨丛匕日期：型：生兰￡：关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(必威体育官网网址论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：半导师签名：日期：型：±!：山东大学硕士学位论文载基因固体脂质纳米粒的研究研究生：叶杰胜导师：张娜教授黄桂华副教授中文摘要近年来，由于基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面的潜在应用前景而备受关注。基因治疗的主要过程是目的基因的获取和高效的基因转染。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因转染体系。基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占 60％以上，但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的致癌致畸性、生产成本高、不能反复应用、转载能力有限等缺点，因此该类载体的应用也在一定程度上受到限制。相反，非病毒型载体制备简单、无免疫原性和比较安全，但是转染效率低是其致命缺点，尤其是在血清蛋白存在的情况下。所以寻找一种既高效又安全的基因载体是基因治疗领域面临的最紧要问题。当前，纳米载体以其转染效率较高、安全低毒、无免疫原性的特点引起越来越多的关注，在该领域，固体脂质纳米粒作为纳米基因载体中的“新秀也吸引了不少研究者的目光。相对于其他纳米载体，固体脂质纳米粒具有许多明显的优势，这其中包括良好的储存稳定性，相对简单的制备过程，可以热压灭菌和冷冻干燥，可以大规模制备等。另外，固体脂质纳米粒主要由生理相容性的材料制备而成，因此该类载体在静脉注射时毒性较小。本文以硬脂酸(或AT0888)和卵磷脂为脂质材料，以增强型绿色荧光蛋白基因(pEGFP)作为报告基因，采用不同的工艺和组装技术制备出三种不同的载基因固体脂质纳米粒。其一是：阳离子固体脂质纳米粒／pDNA二元复合物；其二是：阴离子型载鱼精蛋白．pDNA复合物固体脂质纳米粒；其三是：阴离子型载pDNA固体脂质三元复合纳米粒。课题主要研究方法与结果如下：1．模型基因的选择和制备山东大学硕士学位论文本研究中我们利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠杆菌，并采用柱层析的方法分离纯化质粒。紫外分光光度法对质粒的纯度和含量进行了测定，凝胶电泳法对质粒的单酶切结果进行了鉴定，结果显示质粒纯度符合要求。2．阳离子固体脂质纳米粒．L／pDNA二元复合物的研究本研究中我们制备阳离子固体脂质纳米粒替代传统的阳离子脂质体，以克服后者稳定性不佳的问题。文中以CTAB为表面活性剂采用复乳法制备空白阳离子固体脂质纳米粒，与报告基因复合，加入不同浓度Ca2+调节体系的荷正电量。最终得到的SLNs．pDNA二元复合物的平均粒径为(91．6士5．3)眦，粒径分布均匀，细胞平均存活率相对于阴性对照组均在80％到110％之间，在生理酶浓度条件下，载体具有较好的保护pDNA抗核酸酶降解的能力。体外释放实验结果显示，SLNs．pDNA二元复合物释药符合Weibull模型：lnln[1／(100．R／100)]=．0．4482Int+0．13