脱细胞异种神经移植体复合骨髓基质细胞修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docx

·中文论著摘要·脱细胞异种神经移植体复合骨髓基质细胞修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究刖舌在临床中，对周围神经损伤的治疗常涉及神经移植手术。然而，自体或同种异体神经移植难以避免供区失神经支配及供体来源有限等弊端。随着组织工程学的发展，很多研究致力于研发天然或人工的生物材料，结合种植种子细胞构建组织工程化的神经移植体桥接修复神经缺损。用于修复周围神经损伤的神经移植体应具有良好的生物相容性，近年来通过细胞学、组织学和整体动物学系统地对此方面进行评价成为研究的热点。有研究证明，神经移植体的内部结构和细胞外基质成分对支持细胞迁移和引导轴突延伸起关键作用。Sondell等用化学除垢剂TritonX．100和脱氧胆酸钠萃取脱除周围神经内的细胞，保留施万细胞基底膜管，制备了脱细胞同种异体神经移植体。脱细胞神经移植体作为有生物活性的神经替代物，由生物源性的组织蛋白构成，具有与天然神经相似的结构和生化特征，移植后可使有益于轴突再生的细胞充分地黏附，支持其在支架内迁移增殖并发挥生物学作用，从而改善神经再生的微环境。此外，异体神经来源相对较广，可获得任意长度和直径的神经段，而异种神经的应用则更大地增加了移植体的来源，因此具有良好的临床应用前景。目前，对不同种属哺乳动物脱细胞神经的生物相容性进行评价及应用脱细胞异种神经移植体修复神经损伤的研究极少见报道。施万细胞是周围神经的结构和功能细胞，在神经再生过程中起重要的作用，但是细胞供体的来源、细胞数量有限以及培养扩增耗时长是其作为神经组织工程中种子细胞的主要障碍。理想的种子细胞应是容易获取、迅速增殖、有免疫相容性和能长期存活的细胞。骨髓基质细胞(bonemarrowstromal cells，BMSCs)是一种成体干细胞，具有取材容易、多向分化、增殖迅速、免疫原性低、能合成和分泌神经营养因子等特点。大量研究表明，应用BMSCs作为神经组织工程的种子细胞，可成功地修复中枢和周围神经损伤。周围神经移植术后，除了神经局部的微环境发生一系列复杂的改变外，中枢神经系统和肌肉也相应地作出反应，包括对神经营养因子和某些肽类物质诸如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide，CGRP)等表达的调节，对神经再生起一定的协同促进作用，这些促进神经生长的因子的表达变化与神经损伤后的再生过程密切相关。本实验采用化学萃取脱细胞方法制备不同种属哺乳动物的脱细胞神经，复合BMSCs构建组织工程化的移植体，对脱细胞神经的生物相容性进行体外和体内评价；用同种异体和异种组织工程化的神经移植体桥接大鼠lem坐骨神经缺损，检测术后神经再生和功能恢复的效果；对再生神经进行形态学分析以及定量检测再生组织内促进神经生长的因子的表达，探讨构建的神经移植体促进神经再生的机制，为临床周围神经损伤修复选择来源较广的移植体提供实验依据。实验方法本实验采用化学萃取法制备大鼠和兔的脱细胞神经，应用组织学检测分析其形态结构和成分；皮下埋植后检测其免疫原性；应用MTT法评价其细胞毒性；将BMSCs种植到两种神经支架构建神经移植体，体外培养5d后观察细胞形态、黏附以及在神经移植体内神经营养因子的表达，评价脱细胞神经的细胞相容性。用构建的同种异体和异种神经移植体桥接大鼠坐骨神经lem缺损，术后8w，检测坐骨神经功能指数、神经电生理参数和胫前肌湿重比率，对再生神经进行组织形态学分析；并应用免疫染色和荧光实时定量PCR检测神经、相应的脊髓和肌肉内促进神经生长的因子(包括神经营养因子和肽类)的表达。数据以均数4-标准差(x士s)表示，采用SPSS 13．0软件处理。对于正态分布数据，组间均数比较采用单因素方差分析检验：对于非正态分布数据，组间均数比较采用Kruskal．WallisH检验。P0．05为具有显著性差异。2实验结果l、不同种属的脱细胞神经均较完整地保留了天然立体的施万细胞基底膜管结构和细胞外基质的主要蛋白成分层粘连蛋白，完全地移除了神经内的施万细胞、轴突和髓鞘成分；皮下埋植后未观察到免疫排斥反应；细胞毒性评分为l级；在体外培养中二者均支持种植的BMSCs黏附、生长及分泌神经营养因子。2、神经移植术后，与单纯脱细胞同种异体和异种神经移植组相比，复合BMSCs的异种神经移植体移植能使坐骨神经功能指数增高、潜伏时缩短、波幅增大、神经传导速度增快、胫前肌湿重比率增加、有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径增加；增加再生神经内神经营养因子的表达；增加相应的脊髓和肌肉内脑源性神经营养因子(brain．derivedneurotrophicfactor,BDNF)、睫状节神经细胞营养因子(ciliaryneurotrophicfactors，CNTF)、神经营养