早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证-流行病与卫生统计学专业论文.docx

郑州大学2008届博士学位论文早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证血清标本:收集12例I期肺鳞癌患者及12例正常体检人群的血清。2.研究方法2.1蛋白质组学方法筛选、鉴定早期肺鳞癌相关蛋白2.1.1蛋白样品的处理分别提取6 例I期肺鳞癌患者癌组织及癌旁正常肺组织的可溶性总蛋白，Bradford方法测定蛋白样品浓度，作为分析型和制备型凝胶蛋白上样量的依据，蛋白样品应用2一D dean一uPkit进行除杂处理。2.1.2比较蛋白质组学分析分别将肺鳞癌组和癌旁正常组标本等质量混合，在优化的 2一DE条件下，每组混合样本以分析型蛋白上样量(ncmpH3一10IPG胶条)在相同条件下进行3次2一DE，硝酸银染色后得到肺鳞癌分析型双向电泳凝胶图谱，用Imagescanner图像扫描仪获取凝胶图像，采用ImageMasterZD Plati~ 6.0图像分析软件对2组的全蛋白质组表达谱进行差异分析，分别以各组中2一DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶，进行组间的匹配分析。2.1.3血清学蛋白质组分析方法(sERPA)肺鳞癌组混合样本以转膜型蛋白上样量进行3次2一DE，得到3块平行凝胶(llclnpH3~ 10IPG 胶条)，2块凝胶转膜后分别与肺鳞癌组混合血清及对照组混合血清孵育，经二抗反应和DAB试剂盒显色后获取肺鳞癌组织与肺鳞癌患者血清及对照混合血清的W estem Blot反应图谱。经图像分析软件及人工比对，找出NC膜上差异反应蛋白点并在平行凝胶上定位。结合比较蛋白质组学方法所获取的差异蛋白质点图谱，选择二者共有的差异蛋白质作为肺鳞癌差异蛋白。2.1.4肺鳞癌相关蛋白的鉴定将比较蛋白质组学和SERPA得到的共有差异蛋白点从制备型凝胶(17cmpH3一10，IPo胶条)上挖下，胶内酶解后，经MALDI一ToF一Ms和串联质谱(tandemmass 印eetromet汀，TM s)进行分析，获得肤质量指纹图谱(Peptide M assFinge印rint，pMF)或肤序列标签(p即tideSequeneeTag，pST)，用Maseot软件有哪些信誉好的足球投注网站蛋白质数据库，联合生物信息学，鉴定差异蛋白质性质，作为肺鳞癌相关蛋白的候选标志。乡郑州大学2008届博1:学位论文早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证2.2肺鳞癌差异蛋白ANX I、HSP27及Ran的表达验证2.2.1基因水平的验证提取肺鳞癌患者癌组织和癌旁正常组织的总RNA，逆转录合成cDNA，以p一actin为内参照，采用FQ一PCR方法扩增肺鳞癌相关蛋白ANxl、HSP27及Ran的基因片段，分析转录表达情况及其与患者临床病理特征的关系。2.2.2蛋白表达水平的验证提取肺鳞癌患者癌组织及其癌旁正常组织的可溶性总蛋白，Bradford法测定样品的蛋白质浓度。取适量样品进行SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳，将凝胶上分离的蛋白质转移至硝酸纤维素伽C)膜上，加入特异性一抗和二抗孵育后EcL显色，以p一actin为内参照，检测肺鳞癌相关蛋白的表达情况。2·2.3细胞学定位鳞癌组织及其癌旁正常组织经福尔马林固定、石蜡包埋，连续切片。采用过氧化物酶标记的链霉卵白素(streptavidi可Perexidase，sP)免疫组织化学染色，检测肺鳞癌相关蛋白ANX I、HSP27及Ran的细胞学定位及其蛋白表达情况。3.统计学处理利用SPSS12.0软件对数据进行统计分析。采用t检验比较目的基因的表达差异，卡方检验比较目的蛋白阳性表达率的差异，以a=0.05为检验水准。结果1.早期肺鳞癌相关蛋白的筛选和鉴定1.1对肺鳞癌组和癌旁正常组织组蛋白混合样品分别进行3次2一DE，进行组内和组间匹配，建立分辨率及重复性较高的蛋白质表达谱。肺鳞癌组平均匹配蛋白点数为626个，平均匹配率为87.46%;癌旁正常组平均匹配蛋白点数为602个，平均匹配率为89.21%。在匹配分析的基础上筛选出早期肺鳞癌差异蛋白点38个。1.2建立分辨率及重复性较高的肺鳞癌组织蛋白混合样品与肺鳞癌血清和对照血清的W estem Blot图谱，经软件分析及人工比对筛选出16个差异反应蛋白点，并在转膜后的银染凝胶和平行胶中找到相对应的蛋白质点。结合肺鳞癌组和癌旁对照组组织蛋白混合样品的差异蛋白质点图谱，筛选出10个二者郑州大学2008届博士学位论文早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证共有的差异蛋白质点。1.3在制备胶上挖取相应的差异蛋白点，经MALDI一TOF一M S或TM S进行分析，获得PM F或PST，有哪些信誉好的足球投注网站NCBIn:蛋白质数据库，10个差异蛋白质最终鉴定为膜联蛋白I(ann exinl，ANx l)、热休克蛋白27(heatshoek protein 27，Hsp27)、ras 相关核蛋白(ras一relatednuclearprotein，