小分子化合物诱导小鼠多能干细胞(cipscs)的研究-动物遗传育种与繁殖专业论文.docx

添加7个小分子化合物CHIR98014、Forskolin、616452、DZNep、VPA、 Tranylcypromine、TTNPB，诱导MEF重编程。结果发现，诱导2天后，细 胞形态开始发生变化，8天后形成克隆。mCiPSCs克隆形态与胚胎干细胞类 似，呈现凸起的3D状态，边缘整齐、折光性强、与周围细胞界限明显，细 胞排列紧密、核质比增加。目前已获得4株mCiPSCs细胞系，均可传至10 代以上并保持原有克隆形态。2、初步鉴定了小鼠CiPSCs的生物学特性。结果显示，小鼠CiPSCs 细胞有强的碱性磷酸酶活性(AP)；免疫组化结果显示，表达OCT4、SOX2、 E．cadherin和SSEA．1，未检测到NANOG表达；RT-PCR结果表明，该细胞 表达OCT4、SOX2、KLF4、CDHl、DNMT3B、DAPP4和REXl等；同时， 该克隆在体外可自发分化成三个胚层的细胞，免疫荧光检测到分化的细胞 表达SMA(Mesoderm中)，beta—tutulin(ectoderm外)，SOX 1 7(Endoerm 内)三个胚层的标志蛋白，同时RT-PCR结果也表明这些分化细胞表达三个 胚层的标志基因，分别为Endoderm：FOXA2、HNF4A；ectoderm：NES、 TUBB3；Mesoderm：MEF2C、BMP4、VIM，表明这些获得小鼠CiPSCs样细胞具有体外分化能力。对Nanog基因启动子区甲基化程度检测结果表 明，随小鼠CiPSCs细胞代数增加，Naong启动子区甲基化程度逐渐降低。 3、优化了小分子化合物诱导小鼠CiPSCs体系。探讨了不同浓度 CHIR98014处理对诱导mCiPSCs原代克隆形成的影响，在诱导前8天于诱 导液中添加不同浓度CHIR98014，待克隆形成后统计直径50—120um克隆数， 结果发现，2．5uM CHIR98014浓度更有利于小鼠CiPSCs样细胞重编程，重 编程效率比10或20uM浓度提高3．5倍。筛选了可替代7i诱导液的传代培万方数据养基，在解冻复苏mCiPSCs时，使用4i／LIF(CHIR98014、Forskolin、616452、 PD0325901)培养液，结果显示，与7i液相比，用4i／LIF培养液，更适合 解冻复苏小鼠CiPSCs样细胞传代后细胞的增殖。以上结果表明，在本实验室条件下，已初步建立无血清、化学成分明 确的小分子化合物诱导mCiPSCs体系，且其重编程时间缩短至8天，获得 的mCiPSCs细胞具有一定的多能性。关键词：小分子化合物小鼠CiPSCs重编程多能性万方数据GENERATION 0F INDUCED MOUSE PLURIPOTENT STEMCELLS USING SmLL MOLECULES IN FULLY CHEMICALLYDEFINED M匣DIUMAB STRACTCurrently,there are mainly three methods to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem cells，including cell fusion，nuclear transfer and induced pluripotent stem cell techniques(iPSCs)．In recent years，iPSCs technique had become a very popular approach to obtain pluripotent stem cell in vitro．This method is to apply with specific transcription factor to reprogramsomatic cells into iPSCs which had similar characteristics of embryonic stem cells．However,this technique may cause the viral vector sequence and exogenous transcription factor sequence permanently integrated into the cell genome．Afterward，iPSCs seem to have normal morphology,but there may besome security risks since foreign genes could integrate with host genome and may be overexpressed．The shortage of this me