条斑紫菜基因组fosmid文库构建及mapk基因克隆与表达分析-遗传学专业论文.docx

条斑紫菜基因组FOSM l D文库构建及tWAPK基因克隆与表达分析摘要条斑紫菜(Porplv,,rayezoensis)于具有较高的经济价值和科学研究价值，已经成为海洋生物学基础和应用研究的模式物种。本研究构建了由23040个fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体基因组文库。检测分析表明：文库克隆重组率为100％；插入DNA片段长度集中在28--40kb之间，平均插入片段长度为35kb。经计算文库覆盖率为条斑紫菜基因组的2．78倍。随机选取6个fosmid克隆进行稳定性传代实验，经100代传代后插入DNA片段未发生丢失或长度变化。以条斑紫菜18S rDNA、atpA、h2A、而吐基因为模板设计引物，采用STS．PCR反应池法通过多轮筛选，各得到至少一个阳性克隆。该文库的构建为开展条斑紫菜基因克隆和基因组特性分析奠定了基础。促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-aetivatedProteinKdnases，MAP№)是一类广泛存在于真核生物中的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，处于胞浆信号转导通路的终末位置，可以使多种蛋白磷酸化，包括转录因子，细胞骨架蛋白，蛋白激酶等以调节其他酶活性，并极大影响基因表达，代谢，细胞分裂，细胞形态和细胞存活。。目前对大型红藻蚴P髟基因的的研究尚属空白。．本研究根据己知EST部分序列设计引物。通过构建PCR反应池的方法从fosmid文库中筛选到含有两种MAPK基因的两个克隆，通过DNA步移的方法测序分别得到2321bp和2189bp的DNA序列，其中分别包括PyMAPKl的全序列和PyMAPK2的全序列。PyMAPKl测序得到1458bp开放阅读框(OpenReadingframe，ORF)和251bp的内含子序列。ORF的GC碱基含量为62．96％，内含子的GC碱基含量为55．38％，比外显子的C,-C碱基含量低7．58％。密码子分析发现，PyMAPKl基因密码子第三位偏向于碱基C。通过对PyMAPKl蛋白的二级结构预测分析发现有19个可能的仅螺旋、11个可能的p折叠。PyMAPK2测序得到1515bp的ORF和245bp的内含子序列。ORF的GC碱基含量为64．29％，内含子的GC碱基含量为56．69％，比外显子的GC碱基含量低7．6％。密码子分析发现，PyMAPK2基因密码子第三位偏向于碱基C。通过对PyMAPK2蛋白的二级结构预测分析有19个a螺旋、10个p折叠。对PyMAPKl和PyMAPrd蛋白分析发现了MAPK基因的11个保守结构域。通过功能位点预测发现它们含有胱氨酸结信号域、与激活细胞增殖及DNA合成信号传导相关的EGF结构、蛋白激酶ATP结合特征序列等。其中，PyMAPYd蛋白属于D组MAPK，为植物所特有，不仅含有D组MAPK特征区域KD区，而且含有D组MAPK通常不具有的CD区。蛋白系统发生树分析发现，D组MAPK在进化上相对于其它植物MAPK是单独进化的。而PyMAPKl蛋白含特征基序rrIY，则为一种新类型的MAPK蛋白。蛋白系统发生树分析发现，PyMAPKl不同于其他类型MAPK，在进化上单成一支。。本研究还对机械创伤和活性氧胁迫下的条斑紫菜的PyMAPKl及PyMAPK2表达进行检测，检测结果发现，PyMAPKl和PyMAPK2基因在机械创伤胁迫下都有明显的增加，但开始增加的时间和增加量不同。PyMAPKl转录量增加比PyMAPK2慢且少。在活性氧胁迫下，PyMAPKl转录量有明显增加，开始增加的时间比机械创伤胁迫下早。因此，IPyMAPKl及PyMAPK．2都与机械创伤胁迫相关，而PyMA．PKl也与活性氧胁迫相关。关键词：条斑紫菜；Fosmid文库；促分裂原活化蛋白激酶：实时定量PCR；ConstructionofFOSMIDlibraryofPorphyrayezoensisandcloneandgeneexpressionanalysisofitsMAPKgeneAbstractPorphyrayezoensishasbecomeabasicandappliedresearchmodelspeciesin／narinebiology,owingtothehighvalueofeconomicandscientificresearch．ThefosmidlibraryOfPorphyrayezoensisWaSconstructed．Itcontains23，040clones，andtherecombinationfrequencyis100％．Themostinsertfragmentsarebetween28kband40kbandtheaverageinsertionlengthis35kb．Asaresult,thelibraryis2．78ge