辛伐他汀干预bmscs成骨分化早期β-catenin和psmad158的蛋白表达情况的研究-外科学专业论文.docx

The Vary of β-catenin and pSmad1/5/8 during Osteogenic Differentiation of BMSCs applied simvastatinDissertation Submitted toHebei United Universityin partial fulfillment of the requirement for the degree ofMaster of Medicine byLiu Guangyuan (Surgery)Supervisor:Professor Zhang LiuJune, 2014独创性说明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含 为获得河北联合大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。论文作者签名：日期：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解河北联合大学有关保留 、使用学位论文的规定， 即：已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文 ，学校有权保 留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以将学位论 文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检 索和交流。作者及导师同意论文公开及网上交流的时间：□ 自授予学位之日起；□ 自年月日起。作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要摘要目的 辛伐他汀是一种 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（3-hydroxy-3-methylglutaric acid，HMG-CoA）还原酶抑制剂，以往的大量实验已经证明辛伐他汀具有诱导成 骨 分 化 作 用 , 但 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 （ Bone marrow mesenchymal stem cells ， BMSCs）成骨分化早期的 β-catenin 和 pSmad1/5/8 蛋白表达情况尚未明确。本实验 将就辛 伐他 汀（Simvastatin，SIM ）体外 给 药对大 鼠骨 髓间充 质干 细胞（ Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化早期的影响进行研究。探讨在 成骨诱导成分环境下，辛伐他汀对骨髓间充质干细胞在成骨分化早期 β-catenin 和 pSmad1/5/8 蛋白水平的变化情况。方法 SPF 级 4 周龄雌性 SD 大鼠 20 只，应用颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下 取双侧股骨和胫骨，全骨髓培养法进行原代和传代培养。取第二代细胞随机分为 4 组，对照组（Control medium group，CM）：完全培养基培养；成骨诱导培养基组（Osteoinduce medium group，OM）：含有 10mmol/L β 甘油磷酸钠、50μg/ml 抗坏 血酸和 10-8 mol/L 地塞米松的成骨诱导培养基培养，作为阳性对照；辛伐他汀组（Simvastatin group，SIM）：只含有终浓度为 10-7 mol/L 辛伐他汀的完全培养基； 辛 伐 他 汀 和 成 骨 诱 导 培 养 基 组 （ Simvastatin and Osteoinduce medium group ， OM+SIM）：终浓度为 10-7 mol/L 的辛伐他汀和成骨诱导培养基。CM 组和 SIM 组 分别在 2d、3d、4d、5d、6d 做 MTT 检测细胞增殖情况；CM 组、OM 组和 OM+SIM 组于给药 1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h 后，提取蛋白检测 β- catenin 和 pSmad1/5/8 的蛋白表达水平，第 7d 进行 ALP 染色。结果 1 MTT 检测：10-7 mol/L 浓度的辛伐他汀对细胞增殖和细胞活性无影响，差 异不具有统计学意义（P0.05）。2 ALP 染色：可见 OM 组和 OM+SIM 组细胞胞 浆内出现棕色颗粒，且 OM+SIM 组细胞胞浆内棕色颗粒肉眼观较 OM 组明显染色 增强，Kaplow 积分法评分统计学分析差异具有统计学意义（P0.05），CM 组未 见阳性显色。3 Western Blot 检测：①β-catenin：组内不同时间点比较，OM、 OM+SIM 组内 12h、24h、36h、48h 与 1h、2h、4h、8h 相比 β-catenin 蛋白表达显 著增高，统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。在同一时间点 3 组比较中， 12h、24h 和 36h，OM+SIM 组 β-catenin 蛋白表达量与 OM 组相比明显增高，统计 学