碳酸酐酶ⅲ与肌肉疲劳之间的关系及其对疲劳消除作用的初步观察-运动医学专业论文.docx

复旦大学博士学位论文碳酸配酶nl与肌肉疲劳之间的关系及其对疲劳消除作用的初步观察摘要运动胜肌肉疲劳(Exercise一indueedmuselefatigue)特指运动引起肌肉产生最大随意收缩力量或输出功率暂时性下降的生理现象，它严重影响运动能力的发挥和体能的恢复，是运动医学领域研究的热点问题。其发生机制极其复杂，涉及中枢运动驱动、神经肌肉接头兴奋一收缩祸联和肌肉能量代谢等多种生理过程，其中肌肉基本化学物质的改变是肌肉收缩速度与强度改变的基础，绝大部分中枢神经系统和神经肌肉接头并没有累及。近来研究发现，骨骼肌碳酸醉酶m (Cathonicanhydrasem，cAln)表达水平和/或活性的改变可能与骨骼肌疲劳的发生有关。然而有关肌肉疲劳发生后骨骼肌CAlll的表达情况研究尚未见文献报道，此外，如何在体外大量获取纯化的CA lll，然后将其转导进入骨骼肌以观察其对肌肉疲劳的影响呢? 为解决以上问题，本研究通过大强度跑台运动和低频电刺激的方法建立了大鼠骨骼肌疲劳模型，探讨了骨骼肌C户dll水平与肌肉疲劳之间的关系;构建了含有编码TAT~C户dll全长DNA序列的质粒表达载体并表达纯化出融合蛋白，观察了TA T~C户dll在体内外的跨膜转运能力并通过补充毛灯)CA lll初步观察了其对肌肉疲劳恢复的影响。本研究努以下三个部分:第一部分大鼠骨骼肌疲劳模型的建立及疲劳后肌肉和血清C卢Jll的表达情况目的构建大鼠骨骼肌疲劳模型并观察疲劳后肌肉和血清C Alll的表达情况，探讨CAlll与骨骼肌疲劳之间的关系。方法36只雄性SD大鼠随机分为对照组、运动组和刺激组。运动组参照Bedford方案进行一次大强度跑台运动制作大鼠急性疲劳模型，刺激组采用低频电刺激的方法诱发大鼠胖肠肌疲劳。Westem blot检测大鼠骨骼肌及血清中CAlll的表达水平。结果(1) 与对照组相比，运动组大鼠比目鱼肌CAlll的表达水平明显降低(P0.05)，但趾长伸肌及血清CAln的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。(2) 随刺激时间的延长，大鼠胖肠肌的肌力峰一峰 (P一P) 值及肌力微分值逐渐降低，与刺激开始时相比，刺激10min即有非常显著的差异(P0.01);而疲劳指数(FI)则随刺激时间的延长逐渐增加，刺激40min时FI高达52.14% 左右。(3) 肌电振幅P一P值及EM G时频指标IEM G、M PF和M F值均随刺复旦大学博士学位论文激时间的延长而逐渐降低。与刺激开始时相比，刺激smin时MPF的变化己有显著的差异(P 0.05)，而肌电振幅P一P值及IEM G值在刺激IOmin时方有显著的差异(P 0.05);M F值尽管随刺激时间的延长有所降低，但各时间点差异无统计学意义(P 0.05)。(4)与对照组相比，刺激组大鼠胖肠肌CAin的表达水平明显降低(P 0.05)，而比目鱼肌及趾长伸肌CAlll的表达水平虽均有下降但差异无统计学意义(P 0.05)。结论(1) 低频电刺激致骨骼肌疲劳后的肌电信号变化与运动性疲劳时sEM G信号变化相似，具有一定的特征，表明大鼠胖肠肌疲劳模型建立成功;(2) 急性大强度跑台运动及低频电刺激诱发肌肉疲劳后均可引起相应骨骼肌CA lll的表达下调(前者表现为比目鱼肌，后者为胖肠肌)，表明骨骼肌疲劳的发生可能与其CAlll的表达下调有关。关键词碳酸醉酶m ;骨骼肌疲劳;肌电信号;肌力;肌电振幅第二部分TAT ·C肖Jn融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能的鉴定目的构建含有编码CAlll和TAT.CAlll全长DNA序列的质粒表达载体，并进行诱导表达和纯化，在体内外鉴定TAT~C户dll的跨膜转运能力。方法(1)采用PCR 的方法扩增编码CAlll和TAT~CAlll全长的DNA 序列，分别重组入pET28a质粒表达载体中，测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2l(DE 3)，构建重组体的表达菌株;IPTG 诱导后，用Ni~NTA亲和层析柱分离纯化融合蛋白，纯化产物进行SDS一PAGE分析、W estem blot鉴定及磷酸酶活性染色;(2)分别以1那mo比纯化的CAlll及TA T~CAIn孵育C2C12成肌细胞和PC12 细胞lh，间接免疫荧光法检测两者在细胞内的分布情况;然后分别用含0.1、0.5、1.0、2.0产mo呱1肖工C户dll的无血清培养基孵育C2C12成肌细胞1h和用含1娜mol凡TAT一CAlll的无血清培养基孵育细胞15、30、60、120min，间接免疫荧光染色和Hoechst33342染色观察1人I二CAlll细胞转导率与其浓度和孵育时间之间的关系;(3)分别经胖肠肌肌膜外注射20伽10.25m岁ml的rIAI’-CAlll 和CAlll，注射后30min、6Omin、90min取