新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用-药剂学专业论文.docx

浙江大学硕卜学位论文本研究得到国家自然科学基金的资助浙江大学硕卜学位论文摘要目的:为提高非病毒载体转染细胞后的基因表达水平并延长表达时间，并为骨髓间充质干细胞(MSC)生长创造更好的环境，以期用于软骨损伤的体内再生治疗。方法:1、合成普鲁兰糖一精胺，与DN A 孵育制备普鲁兰糖一精胺/DN A 复合物，考察该复合物的粒径与电位。2、考察基因复合物在不同细胞上的转染效果，利用阴离子化明胶构建反向转染体系，比较反向转染方法与常规转染方法的差异3、在体外选择PE T 无纺纤维与胶原海绵作为支架，结合反向转染构建了反向三维转染体系，在M SC 上考察报告基因转染效果与转染编码TGFp一1 的DNA 后诱导M sc向软骨方向分化的能力。4、以可降解的壳聚糖温敏凝胶与明胶海绵作为三维支架，携载以普鲁兰糖一精胺转染TGFp一1基因的M sc ，考察其软骨修复的能力。结果:普鲁兰糖一精胺心NA复合物可以成功转染MSC。在血清存在情况下，反向转染方法相比常规方法可以产生更高的基因表达。阴离子化明胶的带电性与反向转染体系的转染效率密切相关，所带负电荷的多少可以影响到基因复合物的释放过程，以及血清蛋白在表面上的吸附量。不同的转染方法可能影响到细胞对基因复合物的摄取途径，摄取的改变与载体类别和细胞类型都有关系。培养在三维支架上的MSc 转染后相比二维环境下可以保持更长期的基因表达，在PET无纺纤维上的基因表达水平也更高。以壳聚糖温敏凝胶为支架携载转染pTGFp一1 的M sc 治疗组与未处理损伤组修复效果相似;以含有TGFp一1基因的明胶海绵或经过 TGFp一1基因重组的M sc进行修复，具有一定的软骨修复效果。结论:血清的加入对反向转染体系的基因转染效果不产生明显影响，克服了常规转染时血清对转染效率的负面影响。将反向转染与三维支架结合后更有利于细胞的生长，使M sc 在体外保持长期的基因表达。以明胶海绵携载转染pTGF p一1后的M sC 体内移植后可促进大鼠膝关节软骨损伤修复。关键词:基因治疗;非病毒载体;反向转染;三维支架;普鲁兰糖一精胺;骨髓间浙江人学硕l学位论文充质干细胞;软骨修复浙江大学硕卜学位论文A bstraCtobjeetive:To enLhaneethelevelandProlongthedurationofgeneexPressionforgene一engineeredratmesenehym alstem eells(M SCs)using non一viralvecto几and toProvide a betteren vironm entforthe proliferation o fM SC sforthe eliniealtheraPy ofeartilagedefeet.M ethods:1. Pullulan一sPerm ine w as synthesized and in eubatedw ith PD N A tom akegeneeom Plexes.The Partielesizeand Z etaPotentialoftheg ene eom Plexesw ereinvestigated .2.The transfeetion effeetofgene com Plexesw ere evaluated in v arioustyPesofeells.A reverse transfection system based on anionie gelatin w asd eveloPed.The reverseg en e transfeetion system w asevaluated for theirtransfeetion effieieney aseom Pared w ith the eonventionaltransfection m ethods.3.Collagen sPonge andPolyethylene terePhthalate (PET )non一w oven fabrie were introdueed as seaffolds toPerform three一dim ensional(3D )celleulturew ithreversetransfeetion.PDN A eoding forTGFp一1w asdeliveredtoM SCstoassessitsabilityininducing ehondrogenesis.4.Thebiodegradableehitosan therm o一sensitivehydrogeland gelat