养殖刺参（apostichopus+japonicus）“腐皮综合症”重要病原的核酸检测技术-水产养殖专业论文.docx

养殖刺参(Apostichopusjaponicus)“腐皮综合症”重要病原的核酸检测技术摘要对本实验室鉴定的成参“腐皮综合症”主要致病菌——灿烂弧菌(I巧briosplendidus)的16s一23s间区(Intergenie spacer,IGS)进行了PcR扩增、克隆、测序和分析，设计出针对灿烂弧菌的特异性PcR引物，建立TPCR检测方法。从纯化的所brio splendidus DNA和携带Vibrio splendidus束lJ参组织DNAhb成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片段，该对引物对Hbrio splendidusffg检测灵敏度为0．5pg，与其它细菌圻briofluvialis、I巧brio angillar-um、Hbrioalginolyticus、Aeromonashydrophila、l巧brioharveyi、Vibrioparahaemolyticus、Vibrio vulnf加“s的DNA均无交叉反应。在已建立的所brio splendidusPCR检测方法的基础上利用非放射性标记物地高辛(D．IG)制备了DNA探针，通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行检验，结果表明其对PTbriosplendidus DNA的检出灵敏度为6．25Pg，且无非特异性的反应，说明该探针具有较高的灵敏度及特异性。对人工感染和取自青岛、烟台、威海呈现皮肤溃烂等典型“腐皮综合症”的海参提取溃烂组织DNA，然后用PCR和斑点杂交对上述样品进行检测，阳性检出率均为100％。同时用上述制备的探针进行原位杂交检测，结果证明在体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮和辐水管检测到阳性杂交信号。在建立PCR、斑点杂交及核酸探针原位杂交检测技术等快速检测技术的基础上，对人工感染试验患病刺参溃烂组织、未患病刺参组织以及空白对照组等样品不经过细提组织DNA，通过组织匀浆直接进行快速检测。结果显示：采取粗提DNA的方式进行PCR和斑点杂交快速检测，阳性检出率比细提组织DNA的检出率低，用原位杂交对未出现病症的刺参的阳性检出率低于出现病症海参的阳性检出率。PCR、斑点杂交和核酸探针原位杂交对人工感染试验后发病和尚未发病刺参总的阳性检出率分别是96．9％、90．6％、87．5％。关键词：刺参，腐皮综合症，灿烂弧菌，PCR，斑点杂交，核酸探针原位杂交IIITheNucleicacidDetectionTechnologyOilPathogensofSkinUlcerSyndromeinApostichopusjaponicusAbstractThe16S-23SrDNAIGSsofV．splendiduswereamplifiedandclonedwithpMDl9-TVector,thansequ-enced．Basedonthesequencesanalysisresults，species-specificPCRprimersweresuccessfullydesigneda_ndthePCRmethodsweredeveloped．A177basepair(bp)regionfromthepurifiedVibriosplendidusDNAandinfectedtissueDNAofApostichopusjaponicusWasamplifiedsuccessfully．thesensitivityandspecifi—cityofPCRmethodwerestudied．ThesensitivitytestillustratedthatthedetectionlimitofPCRwas0．5pg矿splendidusDNA，anditwasonlypositivefor矿splendidusDNA。whileitWasallnegativeforDNAsof矿fluvial。矿anguillarum,Ealginolyticus．矿parahaemolyticus,矿harveyi,矿vulnificusandAeromonashydrophila．ThePCRamplificationVibfiosplendidusdescribedabovewaslabeledwithdigoxigenin(DIG)asaP—robeusedfordotblothybridizationandinsituhybridizationtest．ThesensitivityandspecificityWastestedbydotblotbridization．AndthesensitivityWas6．25pgtoVibriosplendidusDNA．Theresultsshowedhighsensitivitya