小鼠胚胎呼吸内胚层形态发生与咽前间充质发育及流出道分隔的关系-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docx

小鼠胚胎呼吸内胚层形态发生与咽前间充质发育及流出道分隔的关系中文摘要研究背景：Hedgehog（Hh）信号转导通路在调节胚胎不同器官的发育、分化过程中发挥重要作用。Hh蛋白是一种成形素，SonicHedgehog（Shh）信号的传递受靶细胞膜上两种受体Ptc和Smo的控制，Shh与其受体Ptc结合，以负反馈调节方式，调节Shh的降解和释放，在组织中形成不同的浓度阈值，诱导胚胎原始细胞向不同的方向分化，并调控胚胎发育过程中的上皮-间充质转化，及Ptc1、Ptc2在组织中的表达强度与Shh的分泌量。Shh受体Ptc1对Shh另一受体Smo有抑制作用，Shh与Ptc1结合，解除Ptc1对Smo的抑制，Smo活性增加，调节下游Gli等转录因子的活性，在不同的组织启动不同的基因表达，控制细胞向不同方向分化。近年研究表明，基因敲除或组织特异性敲除小鼠内胚层Shh基因和Smo基因，引起多种心流出道及心房发育畸形。转录因子ISL-1是第二生心区心肌前体细胞较好的标记蛋白，在原始心管形成后，调控第二生心区间充质细胞向心管内添加不同细胞成分。ISL-1基因敲除小鼠胚胎心脏右心室、流出道及大部分心房组织缺失。胚胎前肠腹侧咽前ISL-1表达阳性间充质是第二生心区的重要组成部分，有关内胚层与小鼠胚胎心发育的关系只限于对转基因、敲基因小鼠的研究，在正常小鼠胚胎心发育过程中，咽前ISL-1阳性间充质与内胚层发育的关系及Shh信号系统成员在内胚层的表达特点尚未见报道。本实验应用免疫组织化学及免疫荧光化学染色方法，观察Hedgehog信号通路中Shh、Ptc1、Ptc2、Smo在前肠内胚层的时空表达特点，探讨其与第二生心区ISL-1阳性间充质细胞在心脏流出道分隔中的相互作用，为进一步研究流出道发育机制，揭示由于基因突变引起的流出道发育畸形而导致的先心病的发病机制以及为条件性敲除内胚层Shh基因后形成的流出道发育畸形提供一定的形态和理论依据。研究目的：探讨呼吸内胚层与咽前间充质细胞发育的关系及对小鼠胚胎心流出道分隔的影响。研究方法：45只胚龄8-13d小鼠胚胎心连续石蜡切片，用抗胰岛因子1（ISL-1）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗音猬因子（音速波状蛋白）（Shh）、抗Patched（Ptc1）、抗Patched2（Ptc2）、抗Smoothened（Smo）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色。研究结果：胚龄8d，ISL-1表达阳性细胞分布在心包腔背侧壁及前肠两侧间充质，并延伸至原始心管动脉端。原始心管心肌显Shh受体Ptc1、Ptc2较强表达，未显Shh阳性表达，不同胚层细胞均可见Smo表达。胚龄8.5-9d，成襻中的心管Ptc1、Ptc2和Smo表达与MHC表达模式相同，Shh在前肠内胚层可见阳性表达。胚龄10-10.5d，动脉囊背侧与前肠腹侧之间的间充质中开始出现ISL-1阳性细胞。呼吸内胚层发育部位显较强Ptc1、Ptc2荧光或强阳性颗粒状染色，同时显Smo阳性表达及MHC阴性表达。胚龄11-11.5d，前肠腹侧较厚的呼吸内胚层上皮表达较强的Ptc1和Ptc2，呼吸内胚层细胞不但显ISL-1阳性表达，以呼吸内胚层为中心，ISL-1阳性的咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层形成对称的锥体形结构。ISL-1阳性细胞同时表达Smo，Shh仅表达于神经管腹侧、脊索、心血管内皮。胚龄12d，在流出道水平，气管上皮及其腹侧的内胚层上皮细胞索变的较为粗短，仍保持较强的Ptc1和Ptc2表达。气管腹侧仍可见ISL-1和Smo双阳性的锥体形结构，顶端指向主肺动脉隔。主肺动脉隔ISL-1阳性表达大部消失，转为较强的α-SMA表达。胚龄13d，Ptc1、Ptc2在气管上皮的表达消失，动脉壁及主肺动脉隔仍可见少量ISL-1阳性细胞，但气管腹侧ISL-1阳性间充质细胞细胞密度明显减低。研究结论：呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集密切耦联。Shh信号系统在呼吸内胚层发育过程中活跃程度较高，发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心，通过Shh信号通路对ISL-1阳性细胞的聚集提供位置信息。呼吸内胚层的正常腹侧延伸不但可诱导ISL-1阳性细胞的正常迁移和流出道的正常分隔，对流出道的正常形态发生及有效的肺循环建立起重要作用。关键词：呼吸内胚层；ISL-1 阳性细胞；Shh；免疫组织化学；免疫荧光；小鼠AssociationofmorphogenesisofpulmonaryendodermwithdevelopmentofprepharyngealmesenchymeandoutflowtractseptationinmouseembryosAbstractBackground:Hedgehog(Hh)signaltransdu