幽门螺杆菌八聚异戊二烯焦磷酸合成酶和精氨酸酶的结构生物学分析-临床检验诊断学专业论文.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 幽门螺杆菌八聚异戊二烯焦磷酸合成酶和精氨酸酶 的结构生物学研究 摘 要 幽门螺杆菌（H. pylori）为革兰阴性微需氧菌，主要定植于感染患者的胃部，是 慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因素，与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的 发生密切相关，世界卫生组织已将其列为一类致癌因子。H. pylori 感染率极高，据统 计，世界人群感染率超过 50%，我国感染人群超过 6 亿人，在某些地局部区感染率甚 至达到 90%以上。虽然 H. pylori 发现至现在已有超过 27 年的历史，对其病原病因学、 流行病学、致病机制、毒力因子、诊断治疗预防方法等也进行了非常深入的研究，但 仍然有很多问题仍不是很清楚，如 H. pylori 感染的持续性和慢性化机制，H. pylori 感 染与胃癌之间的关系，H. pylori 感染率高但发病率低的原因等等。深入阐明其致病机 制，对有针对性地开发治疗的创新药物、设计治疗方案、研制有效的疫苗、制定预防 控制措施具有重要的理论指导意义。 H. pylori 能够成功定植于宿主胃部特殊的生理环境中，粘附胃上皮细胞进而引起 多种胃部疾病，与其所具有的种类和数量众多的致病因子密切相关，如与 H. pylori 毒 力直接相关的致病因子 CagA、VacA、Urease、Hsp60、NAP、OipA、DupA 等；与粘 附和定植相关的 BabA、SabA、SabB、AlpA、AlpB、IceA、HpaA 以及最近几年发现 的新的粘附分子 HP1188 和 HP1430 等；与耐酸相关的有碳酸酐酶、双组份系统蛋白 CrdS/CrdR、ArsR/ArsS 等。这些蛋白都与 H. pylori 的感染和致病有着密切的关系。 蛋白质的结构是其发挥功能的基础，致病因子发挥作用与其独特的空间结构密切 相关。基于此，本研究拟采用结构生物学的方法，解析与 H. pylori 致病和重要生理功 能密切相关的一些蛋白质的结构，通过结构明确其发挥功能和致病的分子机制，为 H. pylori 感染和致病机制研究提供理论指导。本研究共筛选了包括毒力因子、粘附分子、 耐酸相关蛋白以及参与重要生理功能的酶类等 20 个以上的靶标，目前成功解析了其中 两个蛋白质的结构，另有三个蛋白结晶，部分工作仍在进行中。 本论文是对所获得的一些主要实验结果的总结，包括以下几个方面的内容。 第一部分为幽门螺杆菌(H. pylori)八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(OPPs)的结构解析 及酶学机理研究。OPPs催化5个异戊二烯焦磷酸(IPP)与法尼酯焦磷酸(FPP)发生连续的 缩合反应，生成40C的八聚异戊二烯焦磷酸(OPP)，OPP组成CoQ的侧链,后者在呼吸链 的电子传递中发挥了重要作用，敲除该基因后细菌的生长明显受到抑制，提示其功能 的重要性。本研究克隆、表达并纯化了来源于H. pylori的OPPs蛋白，采用该蛋白生长 晶体并收集了2.0 ?的高质量衍射数据，采用MAD法解析了OPPs的结构。通过对结构 的分析，明确了该蛋白的单体结构和二体组装方式、酶活中心的构象以及参与反应的 关键残基等信息，同时分析了该结构与同源结构之间的差异，提出了该家族酶类的底 物招募和产物释放机制，并确定了参与反应终止即控制产物长度的关键残基。通过分 子对接和建模技术获得了底物IPP、FPP、中间产物GGPP与OPPs的复合物结构，在此 基础上提出了trans-异戊二烯家族酶类的可能的催化模型，对该家族酶类的反应机制有 了更加深入的认识。 第二部分为H. pylori精氨酸酶RocF的结构解析及酶活测定体系的建立。精氨酸酶 是尿素循环中的一个关键酶，水解精氨酸生成尿素和鸟氨酸,需要在二价金属离子存在 的条件下才能发挥活性，它是H. pylori耐酸体系的重要组成部分，在H. pylori的适应性 定植中发挥了重要作用。此外，它还通过减少宿主巨噬细胞生成NO和抑制T细胞增生 降低宿主的免疫应答，在H. pylori的免疫逃逸和持续性感染中发挥了重要作用。体内 外实验证实，敲除RocF编码基因后，H. pylori的定植数量明显下降，而这正是通过宿 主NO合成增加造成的，提示RocF在抗机体天然免疫以及在H. pylori的感染和致病中的 重要性。与其他的精氨酸酶相比，RocF有许多不同之处，如在酸性和结合Co2+的条件 下活性最强，还原剂对其活性影响很大，序列中间有一个13个残基的插入，N端C端也 有明显不同等,提示其结构可能与其他精氨酸酶存在差异。基于此，本研究对RocF进行 了克隆表达和纯化，生长晶体并采用分子置换法成功解析了其结构，明确了参与离子 结合的关键残基以及活性中心的位置，并分析了RocF与其他精氨酸酶序列与折叠方式 上的差异。