运用酵母双杂交技术筛选帕金森病相关基因lrrk2相互作用蛋白-遗传学专业论文.docx

中文摘要摘要帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)是一种在中枢神经系统发生慢性和渐进性神经变性病变的疾病，其会损坏机体对随意运动的控制，临床症状为运动徐缓、肌肉强直、静止震颤以及运动失衡等运动系统障碍。PD的病理学特征为黑质致密部多巴胺能神经元缺失，以及在剩余的多巴胺能神经元中出现泛素阳性的kwybody。虽然帕金森病主要是散发的。但是5％．15％与遗传相关。迄今，0【．synuclein、Parkin、UCH—L1、PINKl、DJ．1、LRRK2、ATPl3A2、HtrA2这8个基因是已经确定的与遗传性帕金森病相关的基因。LRRK2基因有51个外显子，编码的蛋白多达2527个氨基酸，包含ANK、LRR、ROC、COR、Kinase和WD40等多个结构域。已经发现的PD相关突变在LRRK2的各个结构域中均有分布，尤以位于Kinase结构域的G2019S最为常见。LRRK2的分子量大约280KD，在脑和其它器官以及细胞系HEK293T中均可表达，功能尚不清楚。已有的研究表明，LRRK2的R1441C、G2019S、12020T等PD相关突变导致LRRK2激酶活性上升，细胞生活力下降，说明这些突变对细胞是有毒性的。而且LRRK2参与调节神经元突起的形态建成，并在突触囊泡蛋白的极性分布中起重要的作用。LRRK2基因突变引起大部分的家族性和一些散发性帕金森病。选用全长的COR功能域和一部分MAPKKK与ROC功能域作为诱饵，用酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库中能与该诱饵相互作用的蛋白。诱饵片段由聚合酶链式反应(PCR)扩增后连入酵母表达质粒pGBKT7，pGBKT7．Bait质粒经测序验证后转化酵母菌株AHl09，用免疫印记(Western Boltting)来检验该质粒在酵母中的表达，人类胎脑cDNA文库被转化到能稳定表达诱饵蛋白的酵母菌株中，并铺到含有X．仅．gal的四缺(SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade)的培养皿上。随后，我们使用分别含有pGBKT7和pGBKT7。Bait的AHl09酵母菌株进行回交检测，进一步确证从初步筛选中获得的阳性克隆。最后用生物信息学来分析这些经再次确证的阳性克隆中的文库质粒。最终获得了9个真阳性的克隆，经生物信息学分析其中有3个克隆中的序列不在已知基因的开放阅读框内。其余6个克隆中的序列在以下几个已知基因的开放阅读框中：STRBP、BAG5、PTPN23、L3MBTL3、硕士学位论文中文摘要RAI，YL、K．IAAl783。经酵母双杂交后成功地获得了真阳性克隆。相信这些相互作用蛋白将为研究LRRK2的功能、帕金森病发病机理和其他神经性疾病提供一些新的线索。关键词：LRRK2、酵母双杂交检验、蛋白质互作Ⅱ硕士学位论文英文摘要ABSTRACTParkinson’S disease(PD)，adiseasecharacterizedbytremor,rigidity,bradycinesia andpostural instability,is a c11ronic and progressiveneurodegenerativedisorderofthecentralnervoussystemthatimpairscontrolofvoluntarymovement．舢ethemajorityofcasesareidiopathic．-5．15％ofcaseshaveageneticcomponent．StudyingtheseraregeneticformsofPDhashighlightedkeycellularpathways，whicharebelievedtoalsobeinvolvedinthepathogenesisofthemorecommonsporadicformsofdisease．ThepathologicalhallmarksofPDpatientsincludeprogressiveloss ofdopaminergic(DA)neuronsinthesubstantianigraparscompactaaswellasthepresenceofubiquitin-positiveLewyneuritisandLewybodiesintheremaining neurons．0【-synuclein，Par珏n，UCH—L1，PINKl，DJ—l，LRRK2，ATPl3A2andHtrA2arelinkedtoinheritedformofPD．LRRK2genehas51exons．TheLRRK2proteinhas2527aa．includingANK，U之R，ROC，COR，Kinase，Ⅵ1D40sixdomains．Thedi