乙肝病毒s蛋白对人精子胞膜完整性及功能的影响-生物化学与分子生物学专业论文.docx

中文摘要【背景与目的】乙型肝炎是严重威胁人类健康和生命的全球性疾病。世界各国共约4亿人为乙肝病毒（HBV）感染者并以每年5千万新感染者的速度递增。我国感染HBV的人数约9 300 万，占全国人口的8%。乙型肝炎在肝癌的发生中占有重要地位，慢性活动性肝炎和肝硬化还是人类致死的主要病因之一。由于该病流行面广、危害性大，因此其传播途径、致病机制及诊疗措施的研究一直是各国政府和科学家们高度重视的课题。已有研究证实，HBV 不仅能够通过血睾屏障整合到男性生殖细胞的基因组中，增加精子染色体不稳定性，诱发多种染色体畸变；而且还能破坏精子线粒体功能，引起线粒体膜电位丧失，导致精子活力受损，受精率和受精指数下降。然而，HBV影响人精子质量和功能的致病机制却鲜有报道。精、卵成功受精需要精子具有完整的细胞膜和正常的功能，这些功能涉及到细胞代谢的维持，精子活力的保持，精子获能、顶体反应、精卵相互作用等事件。本研究的目的是通过研究乙肝病毒S蛋白和人精子细胞氧化应激及凋亡的关系，了解HBs 对人精子细胞膜完整性及功能的影响，揭示HBV 影响精子质量和功能的病理机制。【材料与方法】1.材料(1)乙肝病毒S蛋白（hepatitisBvirussurfaceprotein,HBs）；(2)正常男性精子，经知情同意后取自健康男性自愿者。2.方法人精子细胞与HBs 共孵育后：用2,7-二氯荧光黄双乙酸盐（2′,7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，DCFH-DA）染色法，检测活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的生成；用丙二醛脂质过氧化实验[AldetectTM(MDA-specific)lipidperoxidation(LP)assay]，检测人精子细胞膜脂质过氧化；用铁还原抗氧化剂潜能法（ferricreducingantioxidantpotentialassay，FRAP），检测人精子细胞总抗氧化能力(totalantioxidantcapacity，TAC)；用异硫氰酸荧光素标记的AnnexinV及碘化丙锭(PI)双染法(AnnexinV-FITCandPIdoublestaining)，检测人精子细胞膜磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻；用荧光标记的半胱天冬酶抑制剂(Fluorochrome-labeledcaspaseinhibitors)，检测人精子细胞半胱氨酸蛋白酶-3，-8，-9（caspases-3,-8,-9）的活化；用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling，TUNEL），检测人精子细胞DNA损伤。上述方法中，⑵丙二醛脂质过氧化实验结果、⑶总抗氧化能力结果通过酶标仪分析；其他各种探针标记检测结果通过流式细胞仪分析。【结果】1.人精子细胞与25μg/mlHBs共孵育3h后，ROS阳性精子、AnnexinV＋/PI－精子、Caspases-3,-8,-9阳性精子、TUNEL阳性精子的比率均显著高于对照组；TAC水平显著低于对照组；人精子细胞与50μg/mlHBs共孵育3h后MDA 水平显著高于对照组（P0.05-0.01）。2.MDA水平以及ROS阳性精子细胞、Annexin V＋/PI－精子细胞、Caspases-3,-8,-9阳性精子细胞、TUNEL阳性精子细胞比率的升高与HBs呈剂量依赖关系。3. HBs单克隆抗体和N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可降低DCF 阳性精子细胞的数目。4. TAC水平的降低与HBs 呈剂量依赖关系。【结论】HBs可诱导人精子细胞ROS升高、TAC降低从而产生氧化应激，使细胞膜脂质过氧化；诱发PS外翻、caspases-3,-8,-9激活、DNA损伤而致使人精子细胞凋亡以影响细胞膜的完整性和精子的功能。【关键词】HBs；氧化应激；凋亡；膜完整性；精子功能ABSTRACT[BACKGROUNDAIM]HepatitisB isacommoninfectious diseaseworldwidewhichrepresentsaseriousmenacetohumanhealthandsurvival.AboutfourhundredmillionpeoplehavebeenchronicallyinfectedwithhepatitisBvirus(HBV),androughly50millionnew infectionscontinueto occurannuallyaroundtheworld.InChina,thereare93 millionhepatitisBsurfaceantigencar