瓦氏黄颡鱼(pelteobagrus vachelli)脂肪代谢相关基因cdna的克隆及表达分析-水生生物学专业论文.docx

摘要随着水生动物营养学研究的不断深入和完善，近年来，鱼类的脂类营养巳逐渐成为营养学的一个研究热点。迄今不同学者分别从脂类营养与动物的生长性能、生理学参数，以及生化酶和代谢之间的关系等方面做了大量的工作，但从分子水平上，尤其是有关外源营养索与鱼类代谢相关悔基因之间关系的研究仍颇为缺乏。本论文以瓦氏黄颖鱼(darkbarbel catfish，Peltlωbagrus vachelli)为研究对象，主要从分子角度探讨了脂肪种类、水平等对瓦氏黄颖鱼幼鱼生长和脂肪代谢的影响，研究结果可以为完善瓦氏黄颖鱼人工饲料配方和全价配合饲料的开发提供参考。本论文利用分子生物学技术和生物信息学方法，首先克降了瓦氏黄颖鱼的主要脂肪代谢相关基因肝脂酶(h叩aticlipase，HL)，脂肪酸结合蛋白(fattyacidbindingprotein，FABP) ，脂肪酸合成酶(fatty acid syn伽se，FAS) 和肉碱瞰基转运酶(carnitineacetyltransferase，CAT)的cDNA片段，分析了这些基囚的cDNA序列和分子特征，以及在不同组织中的表达模式。在此慕础上，进行了室内倒养试验，研究了饲料脂肪种类和水平等对瓦氏黄瓢鱼生长参数、脂肪代谢相关基因mRN A 表达的影响，探讨了它们在机体脂肪的分解、转远，以及体内合成等过精发挥的作用。论文的主要结果和结论如下:1 瓦氏黄颗鱼脂肪代谢相关基因的研究本研究根据GenBnak 中提供的生物学信息设计简并引物，采用RT-PCR和克降测序及生物信息学方法、从瓦氏黄颖鱼肝脏中克隆得到肝脂酶，肝型脂肪酸结合蛋白，心搜脂肪酸结合蛋白，脂肪酸合成酶和肉碱瞅基转运酶基因的cDNA 片段。肝脂酶是血液循环中内源性甘油二酶代谢的关键酶之一。本试验克降了瓦氏黄颖鱼肝脂酶的部分cDNA序列。该片段长为1065bp序列，软件分析获得了343个氨基酸，其序列与斑马鱼(Daniorerio)、日本甥蝴(An伊，I.illajaponica)、嫩鱼(Sin伊ercachua衍i)、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、真嗣(Pagrusmajor)的肝脂酶具有很高的问源性，分别为73%、68%、67%、66%和65%。经分析，所得阮氏黄颖鱼肝脂酶氨基酸残基中含有1个糖基化位点，催化中心二联体位点1个和多肤盖等主要的结构功能位点，因而该基因属于脂酶家族。定量PCR分析表明肝脂酶只在肝脏组织中表达，表明瓦氏黄颖鱼肝脂酶的表达具有组织特异性，肝脏是分泌肝脂酶及其行使功能的主要场所。脂肪酸结合蛋白是一类分子量较小，而对脂肪酸有商亲和力的可溶性蛋白质。本试验采用简并引物扩增获得了瓦氏黄赖鱼脂肪酸结合蛋白部分cDNA序列。肝型脂肪酸结合蛋白cDNA片段长为335忡，软件分析获得111个氨基酸残墓，与鲤鱼(Cyprinωcarpio)的肝型脂肪酸结合蛋白的氨基酸序列问源性最高，可达到90%。瓦氏黄颖鱼心型脂肪酸结合蛋白cDNA序列片段长为425bp序列，包括26bp3端非编码区。软件分析后获得114个氨基酸残基，与斜齿蝙(Rutilt俗rutilus)的心型脂肪酸结合蛋白氨基酸序列问源性高达85%。结果表明克隆所得基因序列均属于脂肪酸结合蛋白家族。定量PCR分析表明，瓦氏黄颗鱼肝型脂肪酸结合蛋白在肝脏、腹腔脂肪、肌肉和心脏组织有较商的表达量。心搜脂肪酸结合资自主要在肝脏、脂肪组织和心脏中表达，表明肝脏和腹腔脂肪组织均是肝型和心型脂肪酸结合蛋白表达的主要场所。脂肪酸合成酶能催化机体内脂肪酸的从头合成，生成内源性脂肪酸。本试验采用RT-PCR技术成功分离了瓦氏黄颖鱼脂肪酸合成酶cDNA序列片段，序列长为674bp，软件分析后获得216个氨基酸残基，与斑马鱼(D.rerio)脂肪酸合成酶氨基酸序列问源性最高(87%)，其次是红原鸡(Gal/usgalli邸，79%)、南方短尾负鼠(Monodelphisdomestica，70%)、褐家鼠(Rattusnorvegi俐，，68%)等。定量PCR 分析表明，瓦氏黄赖鱼脂肪酸合成酶mRNA 在肝脏、肠道、腹腔脂肪、心脏组织的表达水平显著高于肌肉等组织(Po.o匀，脂肪酸合成酶mRNA 的表达最上升，有利于促进脂肪酸的生物合成，以满足不同组织细胞分化增殖对脂质营养和能量的需要。肉碱眈3在转运酶属于转运酶家族，能转运从乙酣辅酶A到L肉碱等毗基基因。本试验获得了瓦氏黄颖鱼肉碱毗幕转运酶部分cDNA序列，片段长为494bp，序列软件分析后获得156 个氨基酸残基，与斑马鱼(D.rerio)和红原鸡(6 gaUω)的肉碱毗基转运酶氨基酸序列问源性分别为81%和70%，分析表明所得序列属于瞰其转运酶家族。PCR检测发现fl.氏黄颖鱼肉碱毗慕转运悔