线粒体自噬综述 - 刘思雅.doc

线粒体自噬综述 【摘要】：线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程，在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用，并涉及诸多生理和病理学过程。有关线粒体自噬的研究报道始于21世纪初，近年来发展十分迅速，目前，研究线粒体自噬的方法众多，各有利弊，但没有一种检测手段可以独立说明线粒体自噬的发生或反映线粒体自噬的活性。线粒体通透性改变、过氧化氢酶失活等诸多影响因素都会促进线粒体自噬的发生。最近研究发现PINK1-Parkin信号通路，Mfn1、Mfn2和OPA1等蛋白与线粒体关系紧密，调控线粒体的融合、分裂、自噬。线粒体自噬可能导致神经退行性疾病，主要的神经退行性疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病等。 【关键词】：线粒体自噬的定义；线粒体自噬的研究方法；线粒体自噬的研究意义（线粒体自噬的应用） 线粒体自噬的定义 线粒体自噬指在活性氧、营养缺乏、细胞衰老等外界刺激的作用下，细胞内的线粒体发生去极化出现损伤。损伤线粒体被特异性的包裹进自噬体中并与溶酶体融合，从而完成线粒体的降解，维持细胞内环境的稳定[1]。 一般自噬的分子机制 自噬的生理过程包括以下几个步骤：信号刺激、自噬泡的形成、自噬泡与溶酶体融合、内容物的降解以及降解物的释放。在细胞的正常生理活动中，自噬维持在一个非常低的水平以保持细胞稳态[2]。当细胞处于饥饿、营养因子缺乏的环境或者进行结构调整以及降解胞内代谢产物及损伤细胞器的时候，细胞内的自噬水平会迅速上调，活性氧、感染以及蛋白质产物的聚集都是细胞自噬的诱因。 发生自噬时，细胞内首先形成杯状的自噬泡，并随后将待自噬物质包裹起来。关于构成自噬泡的膜组分的来源尚不清楚。有人认为这些膜组分来源于粗面内质网上的无核糖体区域，也有人认为这些膜组分是一种新合成的结构，因为在自噬泡上没有发现高尔基体和内质网的特异标记物[3]。当吞噬泡特异性或者非特异性的包裹自噬靶标后，形成双层膜结构的自噬体。然后自噬体与溶酶体发生融合，并被溶酶体内的水解酶降解以提供能量产生或者物质再利用[4]。 线粒体自噬的研究方法 目前研究线粒体自噬及其活性的方法主要包括以下三种类型：1）通过电子显微镜或荧光显微镜直接观察线粒体自噬体的结构或线粒体自噬的动态过程；2）通过流式细胞术检测线粒体膜电位、线粒体总量及免疫印迹技术检测线粒体自噬相关蛋白表达量的变化等方法间接反映线粒体自噬活性；3）通过人为对线粒体自噬通路进行实验性调节来全面评价线粒体自噬对细胞或机体形态和功能的影响。 、电子显微镜技术 透射电镜技术始终被认为是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段。线粒体自噬早期形成的线粒体自噬体可以通过线粒体特有的双层膜、线粒体嵴等特征辨别，而其与溶酶体融合形成的线粒体自噬溶酶体仅能通过单层膜或消化后的残留物来大体识别[5]。尽管如此，电镜技术也受到诸多因素的影响，获得的结果存在很大的变性。因此，常规的透射电镜观察方法仅能对完整的线粒体自噬体进行观察，由于选取细胞数量有限，无法反应自噬活性，在定量分析中存在很大的不足。 、荧光显微镜技术 （2.1）、荧光标记基因转染技术 将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与天然荧光蛋白基因连接起来构成融合基因，导入细胞内表达，借助荧光显微镜对标记蛋白进行细胞内活体跟踪，可对线粒体和自噬体进行共定位分析。但是，长时间激发光照射对转染细胞样品的荧光强度有较大影响，而且溶酶体酶活力和胞浆的酸化程度也会影响到荧光信号的检测。 （2.2）、荧光探针标记技术 利用线粒体和溶酶体特异性染色技术也可对线粒体和自噬体进行共定位，在培养细胞中可利用线粒体特异性荧光探针TMRM，Mito Tracker和溶酶体特异性荧光探针LysoTracker染色并结合自噬体的荧光标记技术来追踪线粒体自噬的动态过程。但这些染料的荧光强度随膜电位降低而减弱，因此无法进行细胞固定后检测。另外，非培养条件下线粒体膜电位也会有变化，因此染色后必须尽快完成后续检测。 （2.3）、免疫荧光技术 在固定细胞中，选用线粒体和溶酶体特异性蛋白的抗体对线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体进行免疫荧光标记。然而，线粒体自噬并非受损线粒体蛋白的唯一降解方式，研究者发现许多线粒体外膜及膜间隙蛋白的降解是由Parkin依赖性的泛素蛋白酶系统介导的，还有一部分线粒体外膜蛋白在Parkin的介导下逃逸至内质网以躲避降解[6]，而大多数线粒体内膜蛋白及基质蛋白的降解则是由Parkin依赖性的线粒体自噬介导的，但其具体机制还不清楚。 除了通过线粒体-自噬体和线粒体-溶酶体的共定位来说明线粒体自噬之外，也可以通过线粒体DNA的降解来反映线粒体自噬的活性。 、免疫印迹技术 免疫印迹技术可用于线粒体自噬的定量分析，通过检测线粒体蛋白的表达量变化可反映末期线粒体总量的改变，从而间接反映线粒体