分子生物学诊断技术在血栓-止血性疾病中的应用.pptVIP

分子生物学诊断技术在血栓-止血性疾病中的应用 华西医院实验医学科 周静 主要内容 分子生物学诊断技术的基本原理 遗传性血栓-止血相关疾病及其分子生物学基础 分子生物学诊断技术在血栓-止血相关疾病的应用 1. 基因诊断 定义: 是指应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在、变异和表达状态，从而达到诊断和鉴别疾病的目的。 1. 基因诊断 特点：病因学诊断、基因型诊断、特异性高 应用优势：遗传病的产前诊断、病原微生物感染的潜伏期诊断、携带者检查、家系调查、预测和早期发现疾病 基因诊断的特点 在分子水平上对疾病发生的原因作“基因型”诊断 对材料的要求无组织特异性 基因诊断无个体发育时限性 基因诊断 DNA诊断 分析基因的结构 RNA诊断 分析基因的功能 2. 血栓-止血相关疾病基因诊断必要性 分子生物学诊断技术的基本原理 核酸杂交技术（Hybridization） 基本原理： 不同来源的两条互补核苷酸链在一定条件下形成双链分子的过程。以标记的已知核酸片段为探针，与待测标本核酸进行杂交，通过放射自显影，即可观察到样本核酸中相应的基因。 核酸探针： 带有可检测性标记物的已知核苷酸序列 核酸杂交技术（Hybridization） 碱基互补配对原理：A?T C ?G 变性(Denature)：待测dsDNA转变成单链的过程 复性(Renature)：杂化双链DNA形成的过程 聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR） 其本质是分子核酸杂交 原理和过程与细胞周期DNA复制相似 区别在于DNA在不同温度下快速复性变性，使DNA的复制在体外高速进行 PCR（Polymerase chain reaction）： PCR原理 模板DNA变性 与引物复性 引物延伸与新链合成 PCR的应用 1。诊断基因缺失 利用DNA缺失区域5’和3’端引物进行PCR，通过凝胶电泳观察扩增片段出现与否，以及片段大小，可诊断中等程度的DNA片段缺失。 PCR的应用 2。诊断已知点突变 DNA测序（DNA Sequencing） 双脱氧核苷酸末端终止法 2’,3’-ddNTP 等位基因特异性PCR（AS-PCR）和PCR等位基因寡核苷酸技术 同时使用正常和突变的探针或引物检测已知突变。 限制性片段长度多态性分析(RFLPs) —— 特异性内切酶的消化作用于正常和患者的特异DNA并切割成不同数量/长度大小的片段，通过凝胶电泳和探针杂交可予以鉴别 限制性片段长度多态性分析(RFLPs) 检测原理： 限制性片段长度多态性分析(RFLPs) 应用前提： 基因突变已知 该突变改变了原有的限制性酶切位点 应用局限性： 一次只能完成一个特定位点突变筛查，检测效率较低 仅适于基因突变类型单一所致的遗传病诊断 基因连锁分析技术 利用与致病基因紧密连锁和共同传递的一系列基因组遗传多态标记，通过检测家系先证者，明确与致病基因相关的遗传标记的特点，进而对家系中其他患者的遗传标记进行检测，做出诊断。 基因连锁分析技术 其基本思路： 一个家系中有亲缘关系的个体同时患一种遗传病，其基因异常是共同的 致病基因内及两侧遗传距离极小的多态标记与致病基因紧密连锁，共同传递 先证者遗传标记的特点可被确定 遗传标记的特点在群体中呈多态分布 基因连锁分析技术 X连锁隐性遗传病的基因连锁分析 PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)  原理： 单链DNA分子单个碱基或多个碱基的变异，即可引起其构象改变，使其在PAGE中的迁移率发生变化。 过程： PCR—变性成单链—PAGE—EB染色或银染 PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP) 应用与评价： 同时将正常基因的PCR产物作电泳对照； 缺陷是敏感性低（其敏感性随DNA长度增加而降低，受检片段最适长度约为300bp）； 不能确定突变类型及部位； 常结合DNA测序以确定突变位点及性质 原理： DNA双链的解链温度（Tm）取决于核苷酸顺序，基因突变的存在可使其所在区域的Tm值随之改变。 双链DNA置于含有递增浓度变性剂的PAGE中电泳，Tm值低的区域在较低变性剂浓度中先解链，Tm值高的区域后解链，解链可导致DNA迁移率下降。 根据DNA双链在DGGE中泳动速率的改变而推知Tm值发生了改变，进而找出突变型DNA。 PCR-变性梯度凝胶电泳（ PCR-DGGE ） 评价与应用： 与SSCP相比之下，此法更精确，可检测片段长度达600bp。 反应条件初始化较为复杂。 凝胶制备要一定的设备。 难以检测GC含