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结核病分子流行病学技术 国家结核病参比实验室 王 胜 芬 流行病学 流行病学 流行病学是研究人群中疾病与健康状况的分布及其影响因素，并研究如何防治疾病及促进健康的策略和措施的科学。 应用范围广泛。 研究层次不断深入，宏观研究方法同微观研究技术-分子生物学技术结合。 分子流行病学 产生背景 起源：传染病的传染源追踪和传播途径的分析。 70年代初：分子流行病学是主要是对造成某一疾病流行的病原体，在基因水平上进行分析，从而更准确地解决传染源和传播途径以及有关流行病学问题。 定义 分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关的生物标志或分子事件在人群和生物群体中分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。 分子流行病学 在结核病领域内主要用于： 1、疾病流行规律的研究　如结核病传播范围的确定、传播途径判断与传染源追溯。 2、区别内源性复发、外源性再感染还是混合 感染。 3、近期传播及其危险因素研究。 4、研究耐药菌的传播流行。 5、鉴别实验室污染等。 结核病分子流行病学常用技术 主要包括结核分枝杆菌分子分型技术： 1、IS6110- 限制性片段长度多态性（RFLP）方法 2、 间隔区寡核苷酸基因分型方法 （Spoligotyping） 3、可变数目串联重复-结核分枝杆菌散在分布重复单位（VNTR – MIRU） IS6110- 限制性片段长度多态性（RFLP）方法 IS6110 - RFLP原理 该方法利用结核分枝杆菌基因组中携带多个拷贝的IS6110 以及不同菌株其基因组中IS6110的位置存在显著差异的特点,为每一种结核分枝杆菌提供了一种独特的DNA 指纹图谱。 优、缺点 优点 稳定、可靠、重复性好。是目前国际公认的结核分支杆菌分型的标准方法。 缺点 1、操作繁琐，需提取大量的纯度较高的DNA，3～4 周方能得到结果。 2、对于有6（5）个或更少条带的图谱的分辨力低。极少部分的菌株不含有IS6110插入序列，会产生空白指纹图谱。 3、结果是复杂的图谱，分析复杂，不同实验室的结果比较较为困难。 间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping) 间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping) Spoligotyping 是基于结核分枝杆菌基因组中直接重复区(DR)的多态性的分型方法 (Kamerbeek, 1997)。目前 DR区在 MTC的功能不明 (van Embden, 2000)。 DR区的结构特点 The well-conserved 36-bp direct repeats are interspersed with unique spacer sequences varying from 35 to 41 bp in size. The order of the spacers was found to be well conserved (van Embden, 2000). The region comprised the DR plus the adjacent spacer has been termed the direct variable repeat (DVR) (Groenen, 1993). Currently, 94 different spacer sequences have been identified of which 43 are used for MTC strain differentiation (van Embden, 2000). Clinical isolates of MTC bacteria can be differentiated by the presence or absence of one or more spacers. 操作步骤 基因组DNA分离 PCR方法扩增，包括阳性（H37Rv、BCG）和空白对照。 与固定在膜上的探针杂交 化学发光检测 应用注意 Please note that we do not attempt to derive MTC phylogeny based on spoligotyping. Most of the algorithms for phylogenetic trees are based on the assumption of markers independence. The fact