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6.BAS-ELISA 亲合素可以和四个生物素分子亲密结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。 System 生物素亲合素-ELISA 亲合素：Avidin 生物素：Biotin BAS-ELISA法示意图 应用 由于BAS-ELISA法的放大作用，可对体内含量极微的物质进行检测，例如：细胞因子、粘附分子等的检测。 总之，不同试剂生产厂家,测定同一种物质而设计ELISA方法可有所不同， 但都是在以上几种经典方法的衍化和变通。 ELISA 技术要点包括三个方面： 四、ELISA 的技术要点 试剂制备 反应条件的选择 操作的标准化 1、试剂制备 （2）固相载体选择 （1）抗原和抗体的选择 （5）终止液 （4）底物 （3）酶的选择及标记过程 酶结合物 包被过程 (1)抗原和抗体 ★ 高特异性、高效价、高纯度，高亲合力 效果：Fab段 单克隆 多克隆 用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆。 (２)固相载体 ★ 对固相载体的要求 最常用固相载体 ELISA载体的形状 ①?结合抗体或抗原量大 ②??抗体或抗原固定后洗涤不易脱落 ③??不影响其免疫活性 ④ 抗体Fc段固定于载体，结合位点朝外 对固相载体的要求 ELISA最常用载体：聚苯乙烯 膜载体: 硝酸纤维素膜 聚苯乙烯优点： ①较强吸附蛋白质的性能， ②抗体或抗原能保留免疫活性， ③聚苯乙烯可制成各种形状。 聚苯乙烯缺点： 包被液PH应有9.0左右为宜，小于6.0时非特异性吸附增多。 免疫吸附剂：与固相载体结合的抗原或抗体 ★ 包被过程 包被（coating）：将抗原或抗体固相化的过程 封闭(blocking)：用1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清等包被一次 ，消除高的本底。 包被板的保存 包被板的保存 ： 4℃ 干燥 密封 ★ (3)酶的选择 酶的主要要求 ELISA中最常用的酶 酶的主要要求 ① 酶的高活性，催化效率高 ②?? 抗原抗体反应的最适PH时，酶的活性稳定 ③ 具有可与抗体、抗原或半抗原共价结合的基团 ④? 酶标记在抗原或抗体上时，不影响酶的活性及抗原和抗体的免疫反应性 酶、辅助因子及其底物应易于制备和保存，价格低廉 酶的主要要求（续） ⑤ 判断酶活性，即有色产物光吸收高，易于测定，方法简单，方便、敏感、和精确 ⑥ 酶活性不受样品中的其它成份影响 ⑦? ELISA中最常用的酶 ● ● 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶(AP) HRP的特点： 1）分子量小，标记后较稳定 2）PH稳定范围宽，3.2~12都能催化反应 3）水溶解度好，可配制较高的酶结合物浓度 酶活性表示：即1min将1μmol底物转化为产物所需的酶量。 酶结合物 酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。 ★ 定义： ??技术上不复杂 ?不影响酶催化活性和抗体免疫活性 ?酶结合物，抗原或抗体之间不会聚合 酶结合物制备方法的选择原则： ? 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和抗体蛋白分子中的氨基反应形成Schiffs碱，将两个分子以五碳桥连接起来。 ? 过碘酸盐氧化法将多糖羟基被氧化成活泼的醛基，后者即可与抗体蛋白中的游离氨基形成Schiffs碱而交联，再经硼氢化钠还原终止反应，即得到稳定的酶标结合物。 制备抗体酶结合物常有以下两种： * * 酶免疫技术 武 永 康 四川大学华西医院 实验医学科临床免疫室 一、酶免疫技术定义 免疫技术 标记技术 回顾 标记免疫技术总论 标记免疫技术的分类 放射性标记免疫技术 荧光标记免疫技术 酶标记免疫技术 按标记物的不同分为三类 酶活性：指酶催反应的速率 酶 量：即酶蛋白质的含量 酶量与酶活性的关系 两者呈正相关 酶免疫技术 定义 将抗原抗体特异性反应和酶的高效催化放大作用原理有机相结合的一种新的免疫学方法（enzyme immunoassay EIA）。 a. 免疫反应的高特异性 b. 酶催化反应的高效性及高灵敏度 特点 酶免疫技术的分类 酶免疫组化技术(以后章节讲述) 酶免疫测定技术 二、酶免疫技术的分类 酶