细菌产酶测定-卫生部北京医院.pptVIP

细菌产酶测定 卫生部北京医院 陈东科 1.β-内酰胺酶测定 头孢硝基噻吩（Nitrocefin）纸片法: 用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片浸湿，挑取待检菌落涂抹在Nitrocefin纸片上，10min内变红者为阳性。 2.超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）测定 (1) 单纸片扩散法（初筛试验）： 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、头孢泊肟(Cefprozil,CPD)纸片，置35℃过夜培养，若抑菌环直径CAZ≤22mm、CTX≤27mm、CRO≤25mm、ATM≤27mm、CPD≤22mm时可疑为产ESBLs菌株。 (2). 双纸片协同法（初筛试验）： 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含10μg/片克拉维酸纸片（Clavulanic Acid，CLA）贴于MH平板中央，于克拉维酸纸片周围分别贴上头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟纸片（纸片中心距离为20~24mm），置35℃过夜培养，观察有无协同现象，CLA与任何一种ESC有协同现象者可疑为产ESBLs菌株。 (3).双纸片增效法（确认试验）： 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢曲松/克拉维酸、氨曲南/克拉维酸、头孢泊肟/克拉维酸纸片，置35℃过夜培养后量取抑菌环直径，与单纸片平皿对照，若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径≥5mm，即为ESBLs阳性。 3. AmpC β-内酰胺酶（持续高产型）测定 (1). 单纸片扩散法（初筛试验） 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、头孢泊肟(Cefprozil,CPD)、头孢西丁纸片（Cefoxitin,FOX），置35℃过夜培养，若抑菌环直径CAZ≤14mm、CTX≤14mm、CRO≤13mm、ATM≤15mm、CPD≤14mm、CFP≤14mm时可疑为产AmpC酶菌株。 (2). 双纸片协同法（初筛试验） 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含200μg/片氯唑西林纸片（Flucloxacillin,FCC）贴于MH平板中央，于氯唑西林纸片周围分别贴上头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟、头孢哌酮（Cefoperazone,CFP）纸片（纸片中心距离为15~20mm），置35℃过夜培养，观察有无协同现象，FCC与任何一种ESC有协同现象者可疑为产AmpC酶菌株。 (3). 双纸片增效法 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶/氯唑西林、头孢噻肟/氯唑西林、头孢曲松/氯唑西林、氨曲南/氯唑西林、头孢泊肟/氯唑西林、头孢哌酮/氯唑西林纸片，置35℃过夜培养。与单纸片平皿对照，若加氯唑西林纸片较未加氯唑西林纸片抑菌环直径≥5mm，且对上述超广谱β-内酰胺类抗生素（ESC）耐药，即为阳性。 (4). 三维沟槽法 该方法为较简单的测定去遏制（持续型）AmpC β-内酰胺酶的方法，是唯一能够鉴别AmpC和其它头霉素耐药机理（如外膜通透性降低）的方法。 a.三维试验方法: 将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含30μg/片头孢西丁纸片（Cefoxitin,FOX）贴于MH平板中央，分别在距头孢西丁纸片5mm处，挖三个1×10mm的槽，槽内分别加入40μl AmpC对照菌、ESBLs对照菌及待检菌的初提酶液（超声裂解或冻融的菌液），置35℃过夜培养。 b.粗提酶制备: 1）肉汤振摇培养、超声破碎、低温高速离心法（简称超声破碎法）： 将1ml 0.5Mu的待检菌液接种于50ml MH肉汤中，36℃振摇培养24h后，于4℃条件，6000r/min离心30min，弃上清，用0.1mol/L pH7.0的PBS洗沉淀菌体2次，再用2ml PBS重新悬浮菌体细胞，在冰浴条件下用超声细胞破碎仪破碎菌体细胞（200W, 1min, 间歇1.5min, 共15次），再以 4℃条件，20000r/min离心60min，上清液即为