实验五质粒提取.pptVIP

质粒DNA的小量提取及检测 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子，如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20 个以上，如Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20 多个扩增至1000-3000 个，此时质粒DNA 占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解，细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA 比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA 变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA 片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称 ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时，同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 材料、设备及试剂 三、试剂 1、 LB 液体培养基(Luria-Bertani) ： 蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g 2、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。 3、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 高压灭菌15 分钟,储存于4℃冰箱。 4、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH ，1％ SDS。 5、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L，Ac- 5mol/L。 6. NH4Ac 7.5M 7. 70% 无水乙醇 8、RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。 9、TE 缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 10、电泳所用试剂：（1） TAE 缓冲液 (50×)：（2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。 实 验 流 程 [注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用0.6V体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下