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蛋白质组学 浙江大学 生命科学学院 江 辉 第五章 蛋白质翻译后修饰的鉴定 蛋白质的翻译后修饰 很多前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。 加工的类型是多种多样的，一般分为四种： N-端fMet或Met的切除：原核生物的肽链，其N-端不保留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶（deformylase）除去甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细胞中fMet或者Met一般都要被除去 二硫键的形成 化学修饰 剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟的蛋白 ，如胰岛素 蛋白质的翻译后化学修饰 蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善，调节更为精细, 作用更为专一。 化学修饰的类型也很多，包括磷酸化（如核糖体蛋白的Ser，Tyr和Trp残基常被磷酸化）；糖基化（如各种糖蛋白）；泛素化（要进入蛋白酶体降解的蛋白）；甲基化（如组蛋白，肌蛋白），乙酰化（如组蛋白），羟基化（如胶原蛋白）等。 翻译后化学修饰的生物学效应 泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用; 磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程; 糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用; 脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用; 组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。 蛋白质组学如何在翻译后化学修饰中发挥作用？ 磷酸化 糖基化 蛋白质磷酸化 磷酸化是通过蛋白质激酶将ATP 的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程. 至少有30%的蛋白被磷酸化修饰 大部分蛋白磷酸化是可逆的 磷酸化的作用位点 真核生物的Ser，Thr，Tyr 残基. 原核生物的His，Asp，Glu 蛋白质组学在磷酸化分析中的困难 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的； 即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在； 细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这些酶很容易将磷酸基团脱掉； 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难以质子化的困难。 磷酸化蛋白质的检测 32P放射性同位素法 抗体免疫印迹法 32P放射性同位素法 ?-32P-ATP渗入培养 蛋白样品的制备 双向电泳 检测 考染或者银染 放射自显影 差异点分析 检测 放射性同位素法 优点 灵敏 直观 局限 同位素污染，操作不方便 若磷酸化转换速率低，则难以检测 不能区分不同残基的磷酸化 抗体免疫印迹法 蛋白样品的制备 双向电泳 检测 考染或者银染 免疫印迹（磷酸化特异抗体） 差异点分析 检测 抗体免疫印迹法 优点 灵敏 直观 克服同位素法的局限 无同位素污染，操作相对方便 可检测无磷酸化转换的蛋白 能区分不同残基的磷酸化 磷酸化肽段的分离和富集 使用磷酸化蛋白的抗体 IMAC法 磷酸基团亲和取代 磷酸化蛋白的抗体 目前已经开发出针对特异磷酸化位点的单克隆抗体，?-pTyr， ?-pSer， ?-pThr 利用这些单克隆抗体进行亲和纯化，可以分离和富集特定磷酸化的蛋白 固定金属鳌和亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography ，IMAC) IMAC技术是用于富集磷酸化的肽段，对磷酸化蛋白质的富集是无效的。 利用了磷酸基团的负电性，与IMAC柱上的带正电的金属离子结合，从而起到纯化的作用。 IMAC技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 IMAC技术使用的金属离子主要是Fe3+、Ga3+ 、Cu2+等 最主要的缺点是特异性不强：IMAC柱上的正电荷位点同样会与肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合 对磷酸化肽段中的酸性残基进行了预先的甲基酯化，封闭了上述氨基酸的酸性侧链。 IMAC 磷酸基团亲和取代 将磷酸肽上的磷酸基团用另一种配基取代，再用亲和纯化的方法分离富集磷酸肽 生物素取代 生物素取代 以?-干酪素做测试 磷酸肽的识别 MALDI－TOF－MS结合磷酸酶水解法 磷酸酯酶处理蛋白质的前后，磷酸化肽段的质量数会有变化，比较前后图谱，寻找质量数变化80或98Da和强度增大的信号就很可能是磷酸化肽段。 丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的质量变化可能是80Da，也可能是98Da；酪氨酸磷酸化肽段只有80Da的质量数变化 PSD－MALDI－TOF－MS PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂，丢失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量数减少80kD或者98kD的子离子。 磷酸化位点的确定 用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行