第14章.同位素标记技术在分子生物学实验技术中的应用幻灯片.pptVIP

DNA序列分析 DNA序列分析自动化 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。 荧光标记物 ddGTP ddATP ddTTP ddCTP 单泳道电泳及信号收集 正极 负极 计算机排序 5ˊ GS FLX系统超高通量测序技术原理 GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。  GS FLX系统的操作过程 GS FLX系统提供了完整的从样品制备到后续的生物信息学分析解决方案。 1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。 2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤则不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。 3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DN**段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DN**段。 GS FLX系统的操作过程 4）一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DN**段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DN**段进行平行扩增。 5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DN**段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。 6）数据读取和分析工具：GS FLX系统 在7.5小时的运行当中可获得40多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120 MB的从头测序工作等。 备注 焦磷酸测序(pyrosequeneing)是通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测的测序技术。既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核昔酸多态性(single 年nueleotide polymohism，SNP)检测及等位基因频率测定。 焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’磷酰硫酸(adenosines 5’phosphosuifate，ASP） 备注 和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加人1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺人到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramMT转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加人dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核昔酸序列。 DNA序列分析 DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，则可认为靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的探针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。 DNA杂交测序法 SBH的应用：① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变；② 可用于不同DNA片段之间的序列比较；③ 可用于检测不同生长发育