实验四酶联免疫吸附试验.ppt

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA） ——双抗体夹心法 型号：ThermoLabsystems Multiskan MK3 将酶标仪后部的电源开关打开，仪器将显示自检、基础酶联、软件版本号，随后显示“基础酶联”、“准备！”和具体时间。开机显示主界面后，预热5分钟。 按“调出”键，再按“4”、“输入”键，选择程序4进行测量。（单波长450nm检测、每板第1列为空白） 将96孔酶标板置于酶标板架，（48孔酶标板用黑色配件遮住另外48孔）确认稳固。 按“开始”键，显示“正在读数”，打印机自行打印结果，每组根据数据在半对数坐标纸上画出标准曲线，并得到标本的含量。 再按“开始”键，对下一块酶标板进行数据检测。 * 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA） 酶联 酶标记 免疫吸附 使抗原抗体结合反应在固相上进行 容易洗涤去除未结合的抗原（抗体）和杂质 底物显色标示抗原抗体的特异性结合 双抗体夹心法 间接法 竞争法 Ab 待测Ag Ab-E 底物 （过量） Ag 待测Ab AAb-E 底物 参考管 检测管 Ab Ab Ag-E(一定量） 底物 Ag-E(一定量） 底物 待测Ag 酶和底物 辣根过氧化物酶(HRP) DH2 + H2O2 D + H2O 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) ABTS、5-ASA Add HRP labeled antibody 二、操作步骤 1、装板条（勿摸孔底、注意方向） 2、加抗原（勿刮孔底、勿打出太多气泡） 3、孵育 37℃ 30min（全班同步） 4、甩去孔内液体， 洗涤3次：洗涤液加满、略震晃、甩去、拍干 （注意团队合作） 5、加抗体，每孔100ul 6、孵育 37℃ 30min（全班同步） 7、重复第4步，但洗4次 8、加底物A和B各100ul，略震晃混匀 9、孵育 37℃ （全班同步）10min左右，待色变蓝 10、加终止液50ul，略震晃混匀 11、酶标仪测OD 12、画标准曲线，确定样本浓度 100 100 标本2 待测 待测 待测 待测 400 200 100 50 25 12.5 0 Ag浓度 100 100 标本1 100 100 0 Ag (400ug/ul) 100 100 100 100 100 100 Ag稀释液（ul） 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 孔号 *