第三章 蛋白质的通性、纯化和表征幻灯片.pptVIP

（二）渗透压法测定相对分子质量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）蛋白质的胶体性质 大小在1-100nm范围内； 同种电荷互相排斥； 质点外围有水化层。 （二）蛋白质的沉淀 1.盐析法 2.有机溶剂沉淀法 3.重金属盐沉淀法 4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法 5.加热变性沉淀法 四、蛋白质分离纯化的一般原则 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 (一) 蛋白质含量测定 1.凯氏定氮法 2.双缩脲法 3.酚试剂法 4.紫外吸收法 5.染料结合法 6.胶体金法 7.免疫学方法 8.生物活性测定法 (二) 蛋白质纯度鉴定 常用电泳法、HPLC法、免疫学方法等 (五) 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。 (二) 利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和pH控制 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。 2.蛋白质的盐溶和盐析 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示： lg（S/So）= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。 在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可改写为： lgS = lgSo – KsI = β – KsI β=lgSo为一常数，主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大， 盐析效果越好。 所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I,I可用下式计算： I = 1/2 ∑miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。 盐的选择： 蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25℃时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于溶解度受温度影响大，故应用不广泛。 硫酸铵浓度的计算与调整方法 通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白