细胞凋亡分化.ppt

(三) ELISA法 原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合物，与核小体中的DNA片断结合，最后加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。 三. 凋亡酶学分析 1. 内切核酸酶(endonuclease, DNase) 种类：DNase Ⅰ （内质网、高尔基体), DNase Ⅱ（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胸腺细胞中) 等 作用：使DNA断裂成180－200bp或其倍数的片断 激活机制：CAD(caspase-activate DNase) ICAD(inhibtor of CAD) 检测：Western Blotting 2. Caspases家族 Caspase是半胱氨酸基天冬氨酸－特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)的缩写，共有13个家族成员。可将人体内的caspases分为三个亚家族：①ICE亚家族，caspase-1,4,5, 主要参与炎症反应；②Yama亚家族，caspase-3, 6, 7, 8,10, 主要参与细胞凋亡；③Nedd-2亚家族，caspase-2,9，参与细胞凋亡。 启动型：caspase8,9,10 执行型：caspase3,6,7 Caspases 蛋白酶的共同特点 1. 均为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶； 2. 均含保守的五肽序列(Gln-Ala-Cys-Arg-Gly,QACRG) 3. 均以无活性的酶原形式存在，经蛋白裂解激活 4. 常有异构体形式存在 5. 裂解的最适序列为含Asp的四肽 Caspases作用的一些底物 PARP：DNA修复酶 DNA-PK：参与双链DNA断裂修复的酶 核纤层蛋白(lamins)：核膜的重要结构蛋白 胞衬蛋白(fodrin)：大多数真核细胞 骨架的组成成分，裂解后参与凋亡小体或blebbing的形成 U1小核糖体蛋白的70kD蛋白(U1-70kD)：参与RNA的剪接 其他凋亡相关的酶： 丝氨酸蛋白酶：GranzymeA ,B ,1 Calpains 转谷氨酰胺酶(T Gase): tT Gase 诱导型一氧化氮合成酶(iNOS) Caspases的检测 1. Caspase-3活性测定(FIENA法) 荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物－乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酰胺(Ac-DEVD), 产生发荧光的裂解产物AFC，且caspase-3活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检测 2. 蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测 PARP89kD的检测 四. 凋亡相关蛋白分析 1. Bcl-2家族 促进凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等 抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1等 均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。 2. 其他相关蛋白 p53, Myc, Fas等 流式细胞分析 FLOW CYTOMETRY 流式细胞术的概念 流式细胞术(flow cytometry)是对单个细胞或其他微粒进行快速定性、定量分析与分选的一门技术。 FCM分析细胞凋亡的方法 一. 细胞形态分析 二. 细胞膜结构与功能改变分析 三. 细胞DNA含量分析 四. TUNEL法 细胞凋亡调控障碍 细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性死亡（programmed cell death, PCD）是一种由基因调控的主动有序的细胞死亡过程。 细胞凋亡的生物学特征 一、形态学改变 最早期形态学改变是细胞间的间接丢失 与邻近细胞脱离并失去微绒毛 胞浆浓缩及核质密度增高 （DNA断裂） 调亡小体 识别、吞噬（无炎症反应） 二、生